涼血止血法與活血通絡法調節RVO兔模型凝血因子及微循環作用機制的研究

吳 烈桑子瑾唐 棠夏燕婷吳建國張 楠馬菊梅康 瑋楊迎新張國亮武丹蕾

2北京中醫藥大學東直門醫院

3北京中醫藥大學

4中國中醫科學院西苑醫院

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是繼糖尿病視網膜病變之后第二位最常見的視網膜血管病，也是我國主要的致盲眼病之一。RVO的病因病機十分復雜，屬于難治之證，西醫尚無特效療法。該病屬中醫“血證”范疇，臨床以《血證論》“治血四法”為理論指導采用涼血止血法及活血通絡法取得良好療效。但兩法在治療過程中如何協同作用，作用有何不同，并沒有十分精準的闡述，作用機制也尚未闡明。本研究采用光化學方法建立的RVO兔模型，選擇功效涼血止血的十灰散，以及功效活血化瘀、兼以行氣通絡的血府逐瘀湯進行干預。通過觀察微循環及凝血相關生物學指標，探討涼血止血法及活血通絡法在RVO治療中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：新西蘭白兔39只，雌雄不限，體重2.3 kg～2.5 kg，兔齡 12～16 個月，健康無眼疾，普通級環境分籠飼養。所有動物由中國中醫科學院廣安門醫院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要藥物：十灰散：大薊、小薊、荷葉、側柏葉、茅根、茜根、山梔、大黃、牡丹皮、棕櫚皮。血府逐瘀湯：當歸、生地、桃仁、紅花、枳殼、赤芍、柴胡、甘草、桔梗、川芎、牛膝。水煎制成濃縮液，劑量相當于臨床劑量2倍，參考《藥理實驗方法學》與人折算。

1.1.3 主要試劑：孟加拉玫紅（Sigma公司），TXB2及6-Keto-PGF1α放免試劑盒、ATⅢ及PLG試劑盒 （北京華英生物技術研究所提供），熒光素鈉注射液。

1.1.4 主要儀器：眼底照相機、熒光素眼底血管造影儀、倍頻Nd：YAG激光儀、r-911全自動放免計數儀、ACL TOP全自動血凝分析儀（北京華英生物技術研究所提供）。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：將39只實驗兔以完全隨機法分為4組。正常組3只（6眼）不造模，予生理鹽水；其余4組各9只（18眼）建立RVO模型：模型組予生理鹽水，止血組予十灰散，活血組予血府逐瘀湯，止血＋活血組予十灰散合血府逐瘀湯。

1.2.2 造模方法：麻醉后經耳緣靜脈注射30 g/L（50 mg/kg）孟加拉玫紅溶液，應用氪-綠激光（波長530 nm、能量300 mW、光斑直徑100 μm、持續時間 0.2 s）距離視盤1 PD進行光凝，避開伴行動脈，光凝靜脈選定點的兩側，見靜脈收縮后再光凝中央，形成一段約1/3 PD的靜脈阻塞區域，觀察靜脈血流逐漸變慢直至血流被阻斷，靜脈局部變白。激光干預后，行FFA檢查確定靜脈阻塞形成。激光擊破血管造成玻璃體混濁明顯、影響眼底觀察者、激光誤傷伴行動脈者，排除在本實驗研究范圍以外。

1.2.3 給藥方法：造模后1 h開始給藥，空白對照組用生理鹽水灌胃，2次/d，5 ml/次；中藥各組分別用不同湯藥灌胃，2次/d，5 ml/次，連續給藥 28 d。

1.2.4 觀察內容：（1）FFA檢查：觀察視網膜熒光素滲漏、靜脈阻塞情況。（2）血漿抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）及纖溶酶原（PLG）水平測定：耳緣靜脈采血1.8 ml，注入0.2ml枸櫞酸鈉管，即刻混勻，3000r/min離心10min，取上清于-40℃保存待檢。采用發色底物法測定ATⅢ和纖溶酶原水平。（3）視網膜組織TXB2、6-Keto-PGF1α水平測定：摘除眼球僅留全部視網膜，立即用無菌冷PBS緩沖液漂洗去表面色素及出血，稱重后剪碎，加入9倍重的冷生理鹽水，充分手動勻漿。將勻漿液于4℃，3 500 r/min離心15 min，取上清于-80℃保存待檢。按TXB2、6-Keto-PGF1α放射免疫試劑盒說明書操作。

1.3 統計方法

采用SPSS 13.0軟件進行整理和統計分析，檢驗水準均設立為雙側檢驗P=0.05。總體均數的估計采用配對樣本t檢驗；等級評分比較采用多樣本秩和檢驗（Kruskal-Wallis H Test），若有統計學意義，采用Mann-Whitney U Test兩兩比較。檢驗結果以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FFA視網膜靜脈血管情況（圖1-2）

靜脈光凝處收縮變細，血柱變窄以至消失，光凝靜脈呈臘腸樣節段狀閉鎖，毗鄰視網膜呈灰白色水腫或見散在出血，受阻靜脈直至終末小靜脈明顯迂曲擴張，阻塞區供應動脈痙攣性收縮變細。

2.2 兔血清ATⅢ、PLG水平

2.2.1 各組ATⅢ水平變化：正常組ATⅢ值：79.54%±1.04%（±s）。 模型組：造模 30 min～1 d，ATⅢ水平高于正常組；3～14 d下降并維持在低于正常組水平；28 d緩慢回升接近正常組。止血組：30 min～3 d，ATⅢ水平低于模型組；3～7 d緩慢上升，并高于模型組；14 d逐漸回落至模型組水平；28 d ATⅢ水平緩慢回升但略低于模型組。活血組：造模30 min～1 d，ATⅢ水平與模型組接近；1～3 d持續上升，高于模型組；3～14 d逐漸回落但仍高于模型組水平；28 d ATⅢ水平持續低于模型組。止血+活血組：造模30 min～3 d，ATⅢ水平低于模型組；3～7 d 持續升高；7～14 d 逐漸回落但仍高于模型組；28 d ATⅢ水平低于模型組。各組ATⅢ水平變化見圖3。

2.2.2 不同時間段用藥各組與模型組ATⅢ水平比較：造模30 min～1 d，止血組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組間差異無統計學意義；造模3 d，模型組與活血組差異有統計學意義（P＜0.01），止血組與活血、止血+活血組差異有統計學意義（P＜0.01）；造模 7 d，模型組與止血+活血組、活血組與止血+活血組差異有統計學意義（P＜0.01）；造模14～28 d，各組間兩兩比較差異沒有統計學意義

2.2.3 各組PLG變化規律：正常組PLG值：76.42%±1.37%（±s）。 模型組：造模 30 min～1 d，PLG 水平高于正常組；3～14 d下降并維持低于正常組；28 d緩慢回升至正常組水平。止血組：造模30 min～1 d，PLG水平與模型組接近；3 d明顯下降低于模型組；7～28 d迅速回升并持續高于模型組。活血組：造模30 min～1 d，PLG水平緩慢升高，并持續高于模型組；3～7 d仍高于模型組但開始下降；14～28 d下降并保持在模型組以下。止血+活血組：造模30 min，PLG水平接近模型組；1～28 d走勢與模型組類似但始終略高于模型組（圖 4）。

2.2.4 不同時間段用藥各組與模型組PLG水平比較：造模30 min，PLG水平各組間均無差異；造模1 d，活血組與模型組、止血組差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組間差異無統計學意義；造模3 d，模型組與止血組、活血組，止血組、活血組、止血+活血組之間差異有統計學意義（P＜0.01）；造模7 d，止血組與模型組、止血+活血組差異有統計學意義（P＜0.01）；造模 14 d～28 d，活血組與止血組、止血＋活血組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 兔視網膜勻漿TXB2、6-Keto-PGF1α水平

2.3.1 各組TXB2變化規律：正常組TXB2值：9.82±0.77（pg/mg，±s）。 模型組：與正常組相比，造模 3 d，TXB2水平低于正常組，后持續升高；造模14 d接近正常組；14～28 d持續升高，高于正常組。止血組：造模3 d TXB2水平高于模型組；3～14 d保持平穩；14～28 d接近模型組，持續升高。活血組：造模3～28 d TXB2水平持續升高；均高于模型組。止血＋活血組：造模3～14 d TXB2水平接近模型組，持續升高；14～28 d繼續升高，高于模型組。

2.3.2 各組6-Keto-PGF1α變化規律：正常組6-Keto-PGF1α值：10.27±0.74（pg/mg，±s）。 模型組：與正常組相比，造模3 d時6-Keto-PGF1α接近正常組，后持續升高。 止血組：造模 3～14 d，6-Keto-PGF1α水平緩慢升高，高于模型組；14～28 d，仍升高但低于模型組。 活血組：造模 3～14 d，6-Keto-PGF1α水平緩慢升高，高于 A 組；14～28 d，仍升高，至 28 d 低于模型組。止血＋活血組：造模3 d，6-Keto-PGF1α水平高于模型組；3～14 d， 逐漸降至低于模型組；14～28 d，水平升高但仍低于模型組。

2.3.3 各組TXB2/6-Keto-PGF1α變化規律：正常組TXB2/6-Keto-PGF1α值：0.96±0.02（±s）。 模型組：與正常組相比，造模3 d時比值高于正常組，后持續下降，14 d以后低于正常組。止血組：造模3～14 d比值緩慢降低，低于模型組；14～28 d升高至接近正常組。活血組：造模3 d比值低于模型組；3～14 d緩慢升高，高于模型組；14～28 d轉而下降至接近正常組。止血＋活血組：造模3 d比值明顯低于模型組；3～14 d升高，高于模型組；14～28 d比值降至接近正常組（圖5）。

2.4 不同時間段用藥各組與模型組TXB2/6-Keto-PGF1α 水平比較

造模3 d，模型組與止血＋活血組差異有統計學意義（P＜0.01），其余各組間差異沒有統計學意義；造模14 d，活血組與止血組、止血＋活血組差異有統計學意義（P＜0.05）；造模 28 d，模型組與止血組、活血組、止血＋活血組差異均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

視網膜靜脈阻塞（RVO）是由于視網膜中央靜脈的主干或分支發生阻塞所致的視網膜血液循環障礙〔1〕。當發生RVO后，視網膜血液循環會出現急性的病理改變，早期血液回流發生障礙，管腔壓力增高，小血管及毛細血管破裂出血，繼之出血凝固并殘留于視網膜；微血管反應性擴張，毛細血管通透性增加，視網膜充血水腫加重；后期（1個月后）病情加重者其毛細血管閉塞形成無灌注區，組織缺血、缺氧加重〔2〕。在這一系列病理過程中其凝血機制和微循環調控發生變化，特別是凝血因子及微血管調節因子隨著時期不同發生相應變化。

抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）是主要的血漿抗凝物質，對凝血酶的滅活能力占所有抗凝蛋白的70%～80%，此外，ATⅢ還能抑制凝血因子Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa、Ⅻa 以及纖溶酶、胰蛋白酶、激肽釋放酶等，已有研究報道〔3〕血漿中的抗凝血酶Ⅲ在血栓栓塞性疾病的形成和發展過程中起重要作用。纖溶酶原（PLG）是纖溶系統的最基本核心成分，存在于血液中，在活化素作用下轉變為纖溶酶，其含量減少，表明纖溶活性增強；含量增加，則表明纖溶活性減弱，因此測量血漿中ATⅢ及PLG含量能夠了解機體凝血、抗凝及纖溶系統狀況〔4〕。其含量增高則起抗凝作用，含量降低則起促凝作用。

血栓素 A2（TXA2）、前列環素（PGⅠ2）以及血栓素/前列環素的比率（TX/PGⅠ）是影響血管舒縮的重要因素。Yamanobe 、Mizugaki等〔5，6〕研究認為 RVO 的病變過程與 TXA2、PGⅠ2及其比率（TX/PGⅠ）增高有一定關系。血栓素與前列環素系花生四烯酸的代謝產物，前者是最強的血小板致聚劑，有強烈的縮血管作用；后者有擴張血管的作用，抑制血小板聚集。正常情況下二者處于動態平衡，以維持正常血流狀態。TXA2升高，PGⅠ2下降，即比值升高，則導致血管痙攣、閉塞，加重缺血，反之則導致血管擴張。而血栓素B2（TXB2）和6酮前列腺素 F1α（6-Keto-PGF1α） 是血栓素 A2（TXA2）和前列環素（PGⅠ2）的穩定代謝產物〔7〕。 故實驗中選用TXB2/6-Keto-PGF1α比值作為檢測指標。

RVO屬于中醫“血證”范疇，歷代醫家以《血證論》〔8〕“止血、消瘀、寧血、補虛”治血四法為理論基礎指導臨床治療，取得良好的效果，其中涼血止血法及活血通絡法在RVO治療中是最常用的治法，且常以兩法合用。血府逐瘀湯、十灰散是臨床治療RVO最為常見的基礎方。以往研究表明，血府逐瘀湯能夠促進組織血管的血液循環，有舒張血管，增加血流量，降低血管阻力的功能；可調整凝血及抗凝血系統，防止血栓形成〔9〕。十灰散中的成分能不同程度地縮短出血和/或凝血時間；能增加體內血小板促進血凝〔10〕。從以往的經驗看，涼血止血法具有促凝作用，能夠激活凝血系統和血小板，降低毛細血管通透性，起到止血及減少水腫等作用；活血通絡化瘀法具有抗凝和舒張血管作用，能夠改善微循環，起到促進出血、水腫吸收、增加視網膜供氧等作用。而兩法在治療過程中如何起作用，其分子生物學作用機制有何異同，并不十分清楚。

為了探討中醫藥對RVO病理過程中其凝血機制和微循環調控的作用機制，本實驗從血清抗凝血因子ATⅢ、PLG及影響微血管舒縮狀態的TXB2/6-Keto-PGF1α比值途徑進行初步的研究，以期能說明涼血止血法及活血通絡法在RVO治療作用中的異同。本實驗結果表明，當RVO發生后凝血因子及微循環調控因子在不同時段會發生不同的改變。從動物模型檢測結果發現，在凝血機制方面表現為病變早期（3天內）血清抗凝血因子ATⅢ、PLG較正常組升高，血液系統呈溶血狀態；3天后即開始下降，呈凝血狀態；28天后趨于正常。在微循環方面表現為病變早期（3 天）TXB2/6-Keto-PGF1α比值升高，微血管呈收縮狀態，7天時接近正常，14天后比值降低，并一直保持較低水平，呈舒血管狀態。

中藥對凝血因子及微循環的影響呈雙向調節。在凝血機制方面：涼血止血法在RVO病變早期（3天內）能降低抗凝血因子ATⅢ、PLG，起促凝血作用，利于止血；7天以后（早期）則提高抗凝血因子ATⅢ、PLG水平，可減少血栓形成，14天后該作用減弱；活血通絡法在早中期具有抗凝作用，7天時最強，可減少血栓形成，14天以后作用減弱，后期（28天）有輕微促凝作用；兩法合用組則以抗凝作用為主。在調節血管平滑肌方面：三組藥物在RVO病變較早期（7天）均降低TXB2/6-Keto-PGF1α比值，微血管均呈舒張作用，可能有利于改善組織缺氧，相對而言，兩法合用組早期舒血管作用較強，涼血止血法早期舒血管作用較持久；中期以后（2～4周）比值提高，表現出收縮血管趨勢。

中醫藥的良性雙向調節作用一方面證明了中醫治療的安全性，另一方面我們在臨床應用上應根據疾病不同時段或不同疾病，針對不同的病理狀況進行辨證施治，以提高療效。從本實驗結果看，RVO發生早期（3天），血液系統呈溶血狀態，3天后血液系統開始向凝血狀態發展，因此，臨床上1周內應以涼血止血法治療為主，利于止血，而活血通絡法在早期有抗凝作用，應慎用，以防再出血；發病1周至2周之間，血液系統呈凝血狀態，而這時兩類中藥的作用是向良性調節，涼血止血法和活血通絡法均起抗凝作用，故應兩法合用，且兩法合用在這時舒張血管作用最大，可減少血栓形成。RVO發病2周至4周，血液系統凝血狀態趨于正常，但微血管開始擴張，通透性增加，易造成視網膜水腫、充血，治宜收縮血管，而這時兩類中藥均有收縮血管的作用，同樣應聯合應用。針對RVO的治療，早期應考慮凝血狀態為主，后期則應考慮改善微循環為要。對于4周以后，視網膜毛細血管閉塞形成無灌注區，組織缺血及新生血管增生，這時中醫對改善凝血及微循環的作用機制如何以及對新生血管增生是否有調控作用，由于本實驗尚未涉及，尚無分析結果。中藥在凝血方面及微循環調節方面的作用特別是它的雙向調節功能比較復雜，仍然有待于進一步的深入研究。

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