益氣解毒中藥減少單純皰疹病毒性角膜炎復發的免疫機理研究

關瑞娟 亢澤峰 李 凌 何玉清 馬曉梅 張 蓉

單純皰疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK） 主要是由Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-Ⅰ） 感染后在角膜引起的免疫病理性疾病〔1〕，由于其反復發作、病程遷延的特點，最終造成角膜混濁以致失明。目前尚無確切有效的藥物可以防止單純皰疹病毒性角膜炎復發。 亢澤峰〔2〕等曾對益氣解毒中藥抗HSK 復發進行了臨床研究，結果表明：益氣解毒中藥能夠顯著延長患者復發時間，縮短每次持續時間，具有良好的抗復發效應。 為進一步了解該藥抗HSK 復發的免疫學機理，我們對該藥治療前后患者的外周血T 淋巴細胞及其分泌的細胞因子進行觀察與比較。 現報道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集復發性HSK 患者160 例（青海省人民醫院眼科門診、住院患者)，其中男88 例，女72 例，平均年齡（40.28±9.56）歲，復發次數最少2 次，最多10次。兩組在平均年齡、復發次數及持續時間上均有可比性（P＞0.05）。

1.2 診斷標準與分型〔2〕

1.2.1 診斷標準：①有感冒、發熱或特定的發病誘因，反復發作。②角膜知覺減退，結膜充血。③角膜混濁，呈樹枝狀、地圖狀或盤狀改變。④熒光素角膜染色陽性。

1.2.2 分型：納入研究的患者分為：上皮型角膜炎；非壞死性角膜基質炎；樹枝狀角膜潰瘍。

1.2.3 納入標準〔1〕：①年齡在16～65 歲的患者，男女不限；②符合HSK 診斷標準；③HSK 活動期患者在進入研究前至少復發2 次以上者； ④患有復發性HSK 并經兩名研究者獨立診斷的患者。

1.2.4 排除標準〔3〕：排除壞死性基質型角膜炎、細菌性角膜炎、真菌性角膜炎等其他感染性角膜炎等。

1.2.5 復發標準：出現畏光、流淚、眼痛，角膜上皮缺損呈點狀、樹枝狀或地圖狀，或角膜基質水腫、混濁，角膜熒光素染色陽性，角膜知覺減退等。排除細菌性角膜炎、真菌性角膜炎等其它感染性角膜炎，即診斷為HSK 復發。

1.3 方法

1.3.1 所有患者在急性期觀察臨床總有效率和平均住院日，治療有效者繼續原治療達到臨床治愈，并對患者隨訪1 年，觀察復發情況（失訪率＜20%），3 例無效患者進行住院或轉院治療。

1.3.2 主要試劑：r-INF、IL-18 檢測試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；0.15%更昔洛韋眼用凝膠(湖北科益藥業有限公司)；黃芪桂枝口服液(青海省人民醫院院內制劑，批號：青制字：2000 第Z-0286）。

1.3.3 給藥方法：治療組：生黃芪，炒白術，防風，桂枝，蒲公英，金銀花，密蒙花，蟬蛻，決明子，生姜2片，紅棗1 枚，每日1 劑，水煎服，分2 次服用，14 天為1 個療程。共服藥2 個療程；同時給予0.15%更昔洛韋眼用凝膠點眼，每日3 次。有基質水腫時給予妥布霉素地塞米松滴眼液（ALCON）點眼，每日4 次。伴房水閃輝時給予復方托吡卡胺散瞳。 用藥前后監測肝腎功能，未出現不良反應。 對照組：0.15%更昔洛韋眼用凝膠點眼，每日3 次，有基質水腫時給予妥布霉素地塞米松滴眼液點眼，每日4 次。 伴房水閃輝時給予復方托吡卡胺散瞳。

1.4 T 淋巴細胞亞群檢測過程：青海省人民醫院檢驗科完成。

兩組患者均在治療前后抽取外周靜脈血約3 ml，加肝素（20 μ/ml）抗凝，用淋巴細胞分離液制備淋巴細胞懸液，采用間接免疫熒光染色后再用流式細胞儀檢測T 細胞亞群。 取已制備的淋巴懸液各100 ml，分別加入100 μl 抗CD3、CD4、CD8（鼠抗人）單克隆抗體（Murine Monoclonal Antibody）。 混勻、避光、室溫孵育30 min，加入l ∶200 稀釋的二抗(羊抗鼠Ig-FITC）100 μl 室溫孵育30 min，最后加PBS 液2 ml 上機檢測。 實驗中用PBS 液分別代替一抗、二抗作陰性對照。 每份樣本檢測10 000 個經細胞計數熒光標記陽性的細胞。 采用流式細胞儀檢測所有患者治療前后外周血T 淋巴細胞亞群比例。

1.5 細胞因子（IL-18、IFN-γ）檢測過程（青海省人民醫院檢驗科完成）

1.5.1 標本的采集：選用EDTA 作為抗凝劑，標本采集后將標本放于-20 ℃或-80 ℃保存，進行實驗時提前30 分鐘取出標本，置于2～8 ℃自然解凍，1 000 r/min，離心15 分鐘，但應避免反復凍融。

1.5.2 操作步驟：實驗開始前，提前配置好所有試劑，混勻時盡量避免起泡。 設置好0.01 pg/ml，50 pg/ml，100 pg/ml，250 pg/ml，500 pg/ml，1 000 pg/ml 六個標準品；①加樣；②甩干；③溫育60 min 后，棄去孔內液體，甩干，洗板3 次；④每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液）100 μl，37 ℃，溫育60 分鐘；⑤棄去孔內液體，甩干，洗板5次。 ⑥顯色；⑦依序終止反應；⑧測光密度（OD 值）。

1.6 統計學方法：所有數據均采用SPSS 17.0 統計學軟件進行分析處理；計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t 檢驗，配對資料采用配對t 檢驗，以α=0.05 為檢驗水準進行統計學分析。

2 結果

2.1 兩組臨床療效比較（表1～2）

失訪14 例，失訪率＜20%。 失訪原因：青海幅員遼闊，部分患者家住偏遠地區，交通不便，痊愈后未能復查并且沒有電話。

表1 兩組HSK 患者1 年內復發情況比較（眼數/只，%）

表2 HSK 治愈患者第1 次復發平均時間（天）比較（眼數/只，x±s）

表3 兩組HSK 治愈患者治療前后1 年內復發頻次比較（眼數/只，x±s）

2.2 治療前、后T 淋巴細胞亞群檢測結果

表4 HSK 患者治療組與對照組治療前后CD3、CD4 及CD8 比較（x±s）

由表1～3 可看出，黃芪桂枝口服液可明顯降低患者的復發率、縮短患者每次復發的平均天數。 從表4 可見：治療組治療前、后相比T 淋巴細胞亞群CD3、CD4、CD4/CD8 升高，CD8 下降（P＜0.05）；對照組：治療前后相比CD3、CD4、CD4/CD8 淋巴細胞無明顯變化，CD8 降低，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 治療前后黃芪桂枝口服液對T 細胞分泌的細胞因子的影響

表5 黃芪桂枝口服液治療前后細胞因子比較（x±s）

3 討論

根據中醫“久病致虛，虛易受邪”理論，結合HSK的發病特點，我們認為HSK 反復發作的主要病因是伏邪內傷，新感即發，病機特點為氣虛邪留，邪毒內伏，關鍵環節為“虛”、“毒”，是在邪侵正虛的基礎上，演變為正虛邪戀的互患之勢，以其病、證結合病位，進行辨證論治，以“扶正祛邪”為治則、“益氣托毒”為治法遣方用藥。 方中黃芪、炒白術健脾益氣、托毒外出補后天；合防風固衛表而御外邪；入桂枝調和營衛，助陽制寒；銀花、紫草、蒲公英增清解之力，重在托毒祛邪，以達“正氣存內，邪不可干”之效。

目前治療HSK 最常用的藥物是阿昔洛韋、更昔洛韋、細胞因子、手術治療與基因疫苗學治療。 多年來的臨床和實驗研究均表明，機體免疫功能低下是誘使病毒活化、產生復發的重要原因〔6，7〕，單純采用抗病毒藥物治療，雖然能起到抑制病毒復制、控制當時發作的作用，但因不能徹底清除殘留在眼部或潛伏在三叉神經節內的病毒，一旦遇到過勞、感冒等機體免疫功能低下或應用皮質類固醇藥物等情況時仍可復發。 因此抗復發不僅要抑制潛伏在三叉神經節內HSV-1 再活化，更要重視提高機體的免疫功能，增強自身抗病毒及清除病毒能力，而益氣扶正中藥有明顯的免疫調節作用〔8，9〕。

大多數研究結果表明〔10〕：HSK 復發的主要免疫介質是CD4+T 淋巴細胞及其分泌的相關因子。 Th1所產生的IFN-γ 和IL-18 等細胞因子主宰細胞免疫〔11〕。 IL-18 是一種炎性細胞因子，能夠誘導IFN-γ的產生〔12〕，參與了多種炎性反應性疾病和自身免疫性疾病的發生、發展和轉歸，在免疫反應過程中它促進Th1細胞的活性并促進Th1細胞合成和分泌IFNγ〔13〕。 IFN-γ 是由Th1型細胞分泌的，具有廣譜抗病毒活性，通過人體免疫細胞的細胞酶效應,誘發出多種抗病毒蛋白,調節機體的免疫功能抑制病毒復制與繁殖。有研究結果表明：IFN-γ 在角膜感染的免疫應答全過程中均有表達〔14〕，這有助于抵御HSK 的復發感染。 本研究通過觀察治療前后T 淋巴細胞的變化及其分泌的細胞因子IFN-γ、IL-18 的變化來闡明黃芪桂枝口服液抗HSK 復發的作用機理。

本研究結果表明：黃芪桂枝口服液可以通過調節機體的免疫力來起作用，主要是通過激活CD4+淋巴細胞的活性，促進體內IL-18 的分泌，誘導抗病毒因子IFN-γ 的產生來促進CD+TH1細胞的免疫應答、提高機體的免疫功能、非特異性的阻抑眼部潛伏的HSV-1 再活化，從而降低HSK 的復發。

黃芪桂枝口服液之所以有較好的抗復發作用，就在于本方具有清熱解毒以祛邪治標，益氣固表以扶本護目，祛邪與扶正同施，標本兼治的作用，充分體現了中醫藥“祛邪扶正”防治HSK 復發的基本學術觀點。 在本次研究中我們發現該藥對角膜上皮炎治療效果明顯，而角膜潰瘍后期會出現神經營養性角膜上皮病變，推測本方對此可能也有一定的治療作用，這將在今后的實驗中進行。在進行免疫學研究時未能將淺層型與深層性角膜病變分別研究并且對照分析，針對存在的這些問題，我們將會在今后的研究中予以注意并加以區分。

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