燈盞花素對大鼠胰腺缺血再灌注損傷的保護作用的實驗研究

陳元巖，李天翔，謝明飛，石漢平，宋新民

(1.廣州市中西醫結合醫院胃腸外科，廣東 廣州 510800；2.中山大學附屬第一醫院胃腸外科)

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是指各種病理情況下組織器官缺血一段時間后重新恢復血流，損傷卻進一步加重的現象[1]。能量代謝障礙、氧自由基的產生、細胞內鈣超載、微循環功能障礙及中性粒細胞活化并釋放炎性細胞因子為I/R損傷的主要發病機制[2]。近年來研究表明腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)是參與組織器官I/R損傷的重要細胞因子[3]，細胞凋亡[4]與組織器官I/R損傷有關。燈盞花主要分布于我國西南等省區，具有活血化瘀、改善微循環、通絡活絡、消炎止痛等功效[5]。本實驗研究燈盞花素對大鼠胰腺I/R損傷時血清中TNF-α、IL-1β的變化水平及胰腺組織中Survivin蛋白表達的影響，探討其在胰腺I/R中有無保護作用及其可能機制，為臨床防治胰腺I/R損傷提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 遠交群大鼠(SD大鼠)45只，由中山大學動物實驗中心提供，合格證號：scxk(粵)20080020，體重(220±20)g，雌雄不拘。隨機分為3組：假手術組(A組)、I/R組(B組)及燈盞花素組(C組)，各組大鼠15只，各組根據再灌注時間不同分為0、6、12 h三個時點，各時點大鼠5只，各組無死亡大鼠。

1.2 實驗試劑 大鼠TNF-α、IL-1β免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，燈盞花素注射液(10 ml/支，批準文號Z20040033，云南省玉溪制藥有限公司)，大鼠Survivin免疫組化試劑盒(美國Neomarkers公司)。

1.3 模型制備 所有實驗鼠術前禁食12 h，自由飲水，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定后取腹正中切口入腹，A組在開腹顯露腹腔干和腸系膜上動脈后不作阻斷；B組開腹顯露腹腔干和腸系膜上動脈，用無創血管夾阻斷腹腔干和腸系膜上動脈30 min后松開動脈夾進行再灌注，于再灌注前10 min經尾靜脈推注生理鹽水5 ml/kg；C組按B組手術方法處理，于再灌注前10 min經尾靜脈推注燈盞花素注射液4 mg/kg。操作過程中所有實驗動物腹腔內注入37 ℃生理鹽水0.5 ml/kg，以保持血流動力學穩定。

1.4 觀察指標 各組實驗動物在再灌注0、6、12 h時立即腹主動脈采集血標本約2 ml，2 000 r/min離心10 min，提取血清標本，采用ELIS A方法測定血清TNF-α、IL-1β；具體步驟按試劑盒說明書進行。切取胰腺體尾部組織約1.0 cm×1.0 cm大小，固定于10%甲醛液中，常規病理切片，用于HE染色和免疫組化實驗。免疫組化采用SP染色法，具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行，陽性片由美國Neomarkers公司提供，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。Survivin蛋白陽性染色細胞以細胞質為棕黃色，400倍光鏡下觀察，每片隨機取5個視野，計算陽性與陰性細胞數，最后計算陽性百分率。細胞陽性染色≤10%為陰性表達，染色>10%為陽性表達。

2 結果

2.1 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的變化 在再灌注0、6、12 h時，B、C組血清中TNF-α、IL-1β含量均較A組顯著升高(P<0.05)，但C組增高水平明顯低于B組(P<0.05)，見表1。

表1 各組不同時點TNF-α和IL-1β含量比較

注：與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.2 大鼠胰腺組織Survivin蛋白表達水平的變化 在再灌注0 h時，A、B、C三組胰腺組織Survivin蛋白表達水平比較組間差異無顯著性；在再灌注 6 h、12 h時C組胰腺組織Survivin蛋白表達較A、B組明顯增加(P<0.05)，但A、B兩組間差異無顯著性，見表2，圖1-2。

表2 各組不同時點Survivin蛋白表達水平的比較

注：與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.3 組織形態學改變 光鏡下A、B組各時點未見明顯組織形態學改變；B組在再灌注0 h時見毛細血管擴張充血，炎性細胞浸潤；在再灌注6 h見灶狀壞死、核溶解；在再灌注12 h見片狀壞死。

圖1 Survivin蛋白在再灌注6 h I/R組胰腺組織中的表達(SP染色×400)

圖2 Survivin蛋白在再灌注6 h燈盞花素組胰腺組織中的表達(SP染色×400)

3 討論

引起胰腺I/R損傷的疾病臨床上常見于急性壞死性胰腺炎、腸系膜血管栓塞、胰腺移植、胰腺損傷以及休克等病理情況[6]。其發病機制復雜，其中最主要發病機制與能量代謝障礙、細胞內鈣超載、氧自由基的生成增多及及中性粒細胞激活并釋放炎性細胞因子等有關[7]。I/R時細胞內Na+-K+-腺嘌呤核苷三磷酸(Na+-K+-adenosine triphosphate，Na+-K+-ATP)酶活性降低，膜通透性增加，ATP產生減少，大量Ca2+進入細胞內，激活細胞膜上的蛋白酶和磷脂酶，破壞細胞膜的完整性，干擾線粒體的氧化磷酸化，導致能量代謝障礙，機體免疫功能受損，產生大量炎性細胞因子及氧自由基[8]，其中TNF-α和IL-1β是介導I/R損傷的主要細胞因子，本組實驗結果顯示：在再灌注0、6、12 h時，B組與C組TNF-α、IL-1β同A組相比明顯升高(P<0.05)，提示胰腺I/R后，炎性細胞因子起著非常重要的作用。

細胞凋亡是指為維持機體內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。是一種不同于細胞壞死的生理性、主動性死亡，又稱程序性細胞死亡[9]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是目前發現的最強的凋亡抑制因子，該基因全長15 KB，定位于17q25，含有4個外顯子和3個內含子，其編碼產物為142個氨基酸組成的蛋白，分子量16.2 KD，可阻斷因氧自由基、輻射、缺血缺氧、抗腫瘤藥物等刺激引起的細胞凋亡[10]。

燈盞花素具有改善微循環，舒張血管，減低血管阻力，加快血流，紅細胞解聚，明顯降低血漿黏度、紅細胞聚集指數及紅細胞比容，增加血流量，改善局部供血，抑制血小板積聚等功能[11，12]。此外，研究發現燈盞花素有較強的蛋白激酶C抑制作用[13]，以及能抑制氧化應激和抑制細胞凋亡。從本實驗的結果來看，C組TNF-α、IL-1β增加的程度明顯低于B組(P<0.05)，同時組織病理學結果顯示：C組病理學改變較B組明顯減輕，說明燈盞花素在減輕大鼠胰腺I/R損傷方面有明顯的保護作用；C組Survivin蛋白表達較A組和B組明顯增加(P<0.05)，但A和B組之間差異無顯著性(P>0.05)，表明燈盞花素可以上調I/R損傷時胰腺細胞Survivin蛋白的表達，抑制細胞凋亡。綜上所述，燈盞花素對大鼠胰腺I/R損傷有保護作用，其機制可能上調Survivin蛋白表達有關，但其促使Survivin蛋白表達增強的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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