茅莓提取物體內抗乙型肝炎病毒的實驗研究

柳勤譯，陳曉武，楊小喬，許鳴

(廣東省第二人民醫院消化內科，廣東 廣州 510317)

乙型肝炎是一種全球性分布的病毒傳染病，其感染面廣，傳染性強，易慢性化。我國每年約有40萬人死于與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，HBV)相關的疾病，抗病毒治療是治療HBV最主要的治療措施，目前國內外公認批準有效的抗HBV藥物主要包括干擾素類[1]和核苷(酸)類似物(nucleoside analogues，NA)，但單一抗病毒藥如干擾素需注射治療，不良反應較大，不適用于肝硬化失代償期和白細胞及血小板明顯減少的肝病患者；核苷類藥物，其中以拉米夫定療效最為確切。細胞研究證實，拉米夫定能有效抑制HBV復制，但僅僅抑制病毒DNA的復制量及其復制中間體的產量，核苷類藥物療程難以確定，因此在停止用藥后可發生反跳，長期應用可產生耐藥突變，且副作用大，費用高。與干擾素和核苷類藥物相比，傳統中藥在長期治療HBV過程中體現了其療效穩定、毒副作用小的獨特優勢。中草藥治療HBV的有效性在于它具有促進肝臟細胞的修復、保護細胞膜、調節免疫功能和抑制病毒復制等方面的作用。茅莓是一種傳統民間中藥，據《中藥大辭典》記載，茅莓的根、莖和葉均可藥用，用于治療肝脾腫大、黃疸、慢性肝炎等[2]。目前有國內外學者報道茅莓提取物(乙酸乙酯部分)對HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達均有抑制作用，但尚無茅莓提取物(乙酸乙酯部分)在體內抗乙型肝炎病毒相關方面的報道，為此進行本研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 受試藥物茅莓提取物(乙酸乙酯部分)，為粉末劑由南方醫科大學藥理教研室提供。陽性藥選擇：選擇對鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus，DHBV)抑制作用較強的拉米夫定作為陽性對照藥，規格0.1 g，中國蘇州葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產，批號：H20070581。

1.2 動物 3日齡麻鴨，購自廣西臨桂縣五通鎮孵化場，體重約50 g/只，常規飼養。飼養環境：溫度20～25 ℃，相對濕度60%～80%，定時通風換氣，每日約12 h光照。飼料：寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業有限公司飼料廠生產，40 kg/包。

1.3 主要試劑及儀器 Taq酶，10×PCR buffer、dNTP mixture、6×loading buffer，均購自北京賽百盛生物工程有限公司。引物由北京賽百盛生物工程有限公司合成，梯度聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀，mastercycler gradint 型號5331。高速離心機，Eppenolf 型號5415D。Dyy-6C型電泳儀。NC膜：購自Amersham公司；DHBV質粒：由廣州中醫藥大學熱帶病研究所病毒室提供；缺口翻譯藥盒：購自promega公司；α-32 p-dCTP，購自北京亞輝公司；Sephadex G-50：購自Pharmacia公司；96孔雜交點樣器：美國Bio-rad公司產品；蓋革氏計數器：美國S.E.International 公司產品。常規HE染色所需試劑由南方醫科大學組胚教研室提供。

1.4 方法

1.4.1 模型篩選 DHBV陽性鴨子的篩選：3日齡麻鴨200只于第2天經脛靜脈取血，分離血清后，用常規PCR方法檢測DHBV，第5天出結果，篩選出先天感染DHBV鴨65只。

1.4.2 分組與給藥 取經PCR方法篩選出的先天感染DHBV鴨50只，隨機分為5組，每組10只：茅莓提取物400、200、100 mg/kg組，生理鹽水對照組1 ml/kg；拉米夫定50 mg/kg組，每天灌胃2次，連續灌胃21 d。

1.4.3 取樣方法 在給藥前(T0)，用藥后7 d(T7)、14 d(T14)、21 d(T21)，停藥后3 d(P3)、7 d(P7)自脛靜脈取血分離血清，-20 ℃凍存待檢。停藥7 d后將實驗動物全部頸動脈放血處死，立即摘取肝臟，取肝右葉相同部位組織0.5 cm×0.5 cm大小，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色待檢。

1.4.4 DHBV-DNA 檢測方法取上述鴨血清采用斑點雜交法，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA水平的變化，按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標記DHBV-DNA探針，并作鴨血清DNA斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，在酶標檢測儀上測定OD值(濾光片波長為490 nm)，計算鴨血清DHBV-DNA密度。

1.4.5 肝組織病理學觀察 參照2001年《病毒性肝炎防治方案》及目前國際上常用Knodell HAI、Ishak、Scheuer 和Chevallier 等評分系統或半定量計分方案，了解肝臟炎癥病理變化程度，以及評價藥物療效。本實驗觀察指標：細胞水腫、氣球樣變、間質炎細胞浸潤、點狀壞死。400倍光學顯微鏡下觀察HBV肝組織：(1)細胞水腫：不出現者為(-)；占肝小葉1/2～1/3者為(+)；占肝小葉1/2以上者為(++)；肝小葉廣泛水腫者為(+++)。(2)氣球樣變：評分同細胞水腫。(3)間質炎細胞浸潤：未見者為(-)；偶見者為(+)；廣泛可見者為(+++)；居于(+)與(+++)之間者為(++)。(4)壞死：不出現為(-)；肝小葉出現1～2個壞死灶者為(+)；出現3～4個壞死者(++)，出現4個以上壞死灶者為(+++)。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，多組計量資料分析采用One-way ANOVA，多重比較采用最小顯著差數法(least significant difference，LSD)；雙向有序等級資料采用線趨勢檢驗，兩兩比較采用S-N-K法。

2 結果

2.1 鴨血清DHBV-DNA檢測結果 鹽水對照組動物血清DHBV-DNA水平穩定。拉米夫定口服21 d可顯著抑制血清DHBV-DNA，停藥3 d和7 d后DHBV-DNA顯著回升。茅莓提取物各劑量組各時點血清DHBV-DNA變化差異無顯著性，見表1。

表1 茅莓提取物在鴨體內對DHBV-DNA的抑制作用

注：與對照組相同時間比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與同組T0比較：3)P<0.01

2.2 肝組織病理學顯微鏡觀察 茅莓提取物大劑量組的鴨肝組織內可見重度細胞水腫，但氣球樣變較其他各組輕，未見壞死、纖維化和間質炎細胞浸潤。對照組及各藥物組動物均可見肝細胞重度細胞水腫、氣球樣變性，幾乎無點灶狀及碎屑樣壞死，無纖維增生，可見輕度間質炎細胞浸潤，這些病理表現各組差異無顯著性(P>0.05)，見表2。

表2 各組鴨肝病理變化結果

注：各組肝組織病理檢查，P>0.05

3 討論

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，這個家族的所有病毒都很小，嗜肝性，毒粒形態和基因組相似，復制經RNA逆轉錄，毒粒形態和基因組相似，復制經RNA逆轉錄。一些哺乳動物和禽類嗜肝病毒的發現為人類研究人乙型肝炎病毒的生物學相關機制提供了實驗和道德倫理上的便利。由于禽類嗜肝病毒的DHBV與人乙型肝炎病毒均屬于嗜肝病毒科，兩者在毒粒形態、結構、基因組成、復制及傳播方式等方面均很相似[3-5]。國內目前多選用后天感染的鴨為肝炎的動物模型。國外學者目前普遍采用DHBV感染1～3日齡雛鴨建立乙型肝炎動物模型，通過比較，先天感染DHBV的雛鴨較后天感染模型的血清病毒持續時間長，病毒滴度高；對肝組織的炎性反應長期存在，細胞病變較為明顯，其病毒血癥持續時間較長且較穩定，無明顯的自然轉陰現象，是研究人類乙型肝炎發病機制、病毒復制過程及篩選有效治療藥物的理想動物模型[6]。本研究發現：鹽水對照組鴨血清DHBV-DNA水平穩定，陽性藥物拉米夫定可顯著抑制血清DHBV-DNA，停藥3 d和7 d DHBV-DNA顯著回升，與國內外報道的結果和臨床結果都相吻合。國內外學者報道茅莓提取物(乙酸乙酯部分)對HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達均有抑制作用，且在96 h達高峰，并呈現濃度依賴性和時間依賴性，這說明茅莓提物(乙酸乙酯部分)在體外有抗乙型肝炎病毒的作用，然而在體內茅莓提取物(乙酸乙酯部分)各劑量組21 d療程各時點血清DHBV-DNA變化差異無顯著性[7-8]。這結果顯示茅莓提取物經過體內代謝后在鴨體內對DHBV-DNA無抑制作用?？紤]原因有：(1)茅莓提取物在體內確實無抗病毒作用，與國內報道的有相當多的藥物體外有抑制病毒復制作用，而體內并無抗病毒作用相一致。(2)給藥劑量不足不能達有效血藥濃度，茅莓提取物在細胞試驗中已表現出對HBsAg和HBeAg的表達抑制，并呈現出濃度依賴性和時間依賴性。(3)給藥途徑的影響，茅莓提取物在給鴨灌胃經鴨體內代謝后抗病毒的有效成分可能已經被破壞。(4)給藥時間可能太短，目前常用兩大類抗病毒藥物都需要長期用藥，作用機制不同，藥物起效需要的時間也不一樣。

綜上所述，本實驗研究中發現：茅莓提取物(乙酸乙酯部分)抗乙型肝炎病毒作用主要是通過其原形發揮作用，該原形在麻鴨體內經過代謝后，失去抗乙型肝炎病毒的作用。

參考文獻：

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