血糖波動對人臍靜脈血管內皮細胞腺苷酸活化蛋白激酶和過氧化物酶增殖物激活受體γ共激活因子1α的影響

田翰林，常柏，田文靜

據世界衛生組織統計，2014年全球成年人群糖尿病(DM)發病率高達9%[1]，2015年國際糖尿病聯合會數據顯示，全球DM患病人數已達到4.15億，我國2015年DM患病人數居世界首位，高達1.1億[2]。同時DM大血管病變是公認的高致殘疾病因素。近年中外研究發現，血糖波動相較于單純性高血糖對血管內皮損傷更為嚴重，具體機制尚不明確。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一個由α、β、γ亞基形成的三聚體，被稱為細胞能量的“燃料開關”“感受器”“低能警示系統”。受磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)比值調控，對細胞內能量代謝極為敏感，同時影響生理性一氧化氮(NO)產生、caspase-3凋亡因子表達，從而影響血管內皮的功能[3-4]；過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子1α(PGC-1α)作為AMPK的下游效應分子，參與線粒體系統合成和個體合成的過程，從而影響內皮細胞能量代謝[5]。本研究于2016年12月通過蛋白質印跡法(Western blot)和反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別檢測高糖/血糖波動下人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中AMPK、PGC-1α的蛋白表達與信使RNA(mRNA)表達，以探討血糖波動對血管內皮的影響。

1 材料與儀器

HUVECs(天津醫科大學內分泌研究所)，DMEM培養液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibcu公司)，肝素鈉、明膠、內皮細胞生長因子(Sigma公司)，AMPK，PGC-1α抗體，anti-β(CST公司)。顯微鏡、全自動圖像分析儀(日本奧林巴斯公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)，臺式低/高速離心機(德國Eppendorf 公司)，PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1細胞培養實驗分組和干預HUVECs復蘇后用含10% 胎牛血清的5 mmol/L含葡萄糖和氨基酸(Glu DMEM)的低糖培養液，置于37 ℃，5%CO2無菌培養箱內培養。每24 h換液一次，每2～3 d傳代1次。取對數生長期的第3代HUVECs，倒掉培養液，經胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以105/mL濃度接種于六孔板中，參照文獻[6]設計血糖濃度、換藥時間以及分組模式，將細胞分為三組：正常組用5 mmol/L Glu DMEM培養液，每24 h換液一次(模擬正常糖環境)；高糖組用25 mmol/L Glu DMEM培養液(模擬高糖環境)，每24 h換液一次；血糖波動組用25 mmol/L Glu DMEM培養液和5 mmol/L Glu DMEM培養液，每8 h交替更換一次培養液(模擬血糖波動環境)，將三組模型置于37 ℃，5%CO2細胞培養箱培養48 h，對相應指標進行觀察。

2.2流式細胞儀技術檢測HUVECs凋亡用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2 次，2 000 r/min離心5 min，收集1×105～5×105細胞；將細胞重懸于結合緩沖液500 μL，加入Ca2+依賴性磷脂結合蛋白(Annexin V-FITC)5 μL和核酸染料(PI)5 μL，輕混勻，室溫避光反應15 min，1 h內進行分析。流式細胞儀激發波長Ex=488 nm。用未經凋亡誘導處理的正常細胞作為對照，進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置，每組做3個平行反應。

2.3Westernblot檢測高糖及血糖波動對AMPK和PGC-1α蛋白表達的影響取干預后的細胞用預冷的PBS沖洗兩遍，加入細胞裂解液5 min，12 000 r/min低溫離心15 min，聚氰基丙烯酸正丁酯試劑檢測法(BCA法)檢測總蛋白量，每樣品取20滴上樣，蛋白質雙向電泳(DS-PAGE電泳)分離，轉膜，10 V恒壓通電80 min。加一抗：抗AMPK(1∶1 000稀釋)、抗PGC-1α(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育。辣根過氧化物酶(HRP)標記的特異性二抗(1∶2 000) 及HRP標記的抗生物素抗體(1∶1 000) 室溫下孵育1 h。顯影、定影、洗片。結果用凝膠成像軟件定量掃描條帶灰度，以目的蛋白條帶/β-acting蛋白條帶的比值反映各自的蛋白表達水平，每組取6個樣本測試。

2.4RT-PCR檢測高糖、血糖波動對AMPK與PGC-1αmRNA表達影響將干預后的細胞，超純RNA提取試劑盒提取組織總RNA，引物序列：AMPK上游引物5′-TGGCAAACATGAATTGACTGG -3′；下游引物5′-GCTTGAGGTTCTGAATTTCTCTG-3′；產物長度113 bp；PGC-1α上游引物：5′-AGAAGCGGGAGTC TGAAA GG-3′，下游引物：5′-CAGTTCTGTCCGCGTTGTG-3′，產物長度 483 bp；用HiFi-MMLVcDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，反應條件：95 ℃預變性10 min，1個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，共45個循環。擴增后，60～95 ℃進行融解曲線分析，目的基因和對照基因的Ct值經熒光定量分析儀自動采集給出，采用2-ΔΔCt法計算基因相對量，每組取6個樣本測試。

3 實驗結果

3.1各組內皮細胞凋亡率比較數據及統計結果見表1。整體分析(單因素方差分析)及兩兩比較(LSD-t檢驗)顯示：內皮細胞凋亡率的4個指標，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。結合數據看：早晚期細胞凋亡指標由高至低依次為血糖波動組、高糖組、正常組；機械損傷細胞指標由高至低依次為高糖組、血糖波動組、正常組；存活細胞指標由高至低依次為正常組、高糖組、血糖波動組。

表1 高糖、血糖波動對HUVECs凋亡率影響

注：兩兩比較顯著性標記a、b分別為和正常組、高糖組比較，P<0.05

3.2各組內皮細胞AMPK和PGC-1α相對蛋白表達的變化各組細胞AMPK和PGC-1α蛋白條帶圖見圖1，數據及統計結果見表2。整體分析(單因素方差分析)及兩兩比較(LSD-t檢驗)顯示：各組內皮細胞AMPK和PGC-1α蛋白表達，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。結合數據看：均以血糖波動組為最低，正常組最高。

圖1 不同血糖水平下臍靜脈內皮細胞AMPK和PGC-1α蛋白的表達

3.3各組內皮細胞AMPK和PGC-1α相對基因表達的變化數據及統計結果見表3。整體分析(單因素方差分析)及兩兩比較(LSD-t檢驗)顯示：細胞AMPK和PGC-1α相對基因表達，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。結合數據看：兩基因表達水平都是血糖波動組為最低，正常組最高。

表2 各組細胞AMPK和PGC-1α相對蛋白表達

注：兩兩比較顯著性標記a、b分別為和正常組、高糖組比較P<0.05

表3 各組細胞AMPK和PGC-1α相對基因表達

注：兩兩比較顯著性標記a、b分別為和正常組、高糖組比較,P<0.05

4 討論

高血糖可直接損傷內皮細胞，誘發其分泌與釋放趨化因子、黏附分子等炎性介質的平衡失調，以至于刺激血管內皮細胞炎癥反應；同時高糖可間接引起內質網應激、胰島素抵抗、氧化應激和脂代謝紊亂等病理反應，導致內皮細胞功能紊亂，降低存活率，促進凋亡。高糖環境亦可活化多元醇通路，增強己糖胺途徑，蛋白激酶C 激活等，導致改變細胞氧化還原狀態，介導細胞功能損害[7-8]。血糖波動對血管功能造成損害是多途徑的，且其對血管內皮細胞的損傷相較于單純性高糖更為嚴重[9-10]。本研究結果顯示，體外血糖波動及持續高糖培養可誘導HUVECs發生凋亡，且血糖波動組凋亡率高于高糖組。

AMPK受AMP/ATP比值調控，氧化應激、缺血缺氧、代謝產物等導致AMP/ATP比值升高的因素都可通過AMPKα1亞基172位蘇氨酸磷酸化或直接變構激活AMPK。AMPK激活后，通過下游SIRT1/PGC-1α 信號途徑，引起線粒體氧化磷酸化能力增強，開啟生成ATP產能的途徑[11]。AMPK也通過對游離脂肪酸(FFA)氧化的促進從而拮抗FAA造成的內皮細胞脂毒性，以此對血管內皮產生保護[12]。AMPK通路中，其通過調節內皮-氧化氮合酶活性，刺激NO 的產生，改善內皮功能[13-14]。活化的AMPK 通過其下游的靶分子如組蛋白脫乙酰酶(SIRT1)、FOXO和PGC-1α抑制核因子-κB(NF-κB)信號，隨后降低炎性因子的表達[15]。高糖引起的血管內皮細胞中caspase-3的活性在AMPK激活時可被抑制，從而減少細胞凋亡[16]。

PGC-1α作為AMPK的下游效應分子，AMPK不僅能增加PGC-1α的表達，且直接能夠導致其磷酸化，此過程是PGC-1α依賴性介導的PGC-1α的啟動子激活所必需的。研究表明：細胞能量代謝中線粒體起著決定性作用，作為能量代謝最重要的場所，對細胞生長、增值、凋亡以及信號轉導等過程直接參與。而線粒體的生成中PGC-1α可能是其關鍵調控因子，可對生物刺激調控線粒體表達與合成直接做出相應反應[17-18]。被PGC-1α調控的線粒體生成信號途徑可能是修復與維持血管內皮細胞線粒體功能的一項主要機制[19]。

本研究中，在高糖及血糖波動狀態下血管內皮細胞AMPK和PGC-1α蛋白表達和mRNA表達都呈下降表現，而且血糖波動狀態下的表達下降更為明顯，細胞凋亡率也更高，但具體損傷機制尚不明確，考慮與血糖波動狀態下改變了內皮細胞能量代謝平衡，導致能量消耗異常以至于AMP/ATP比值改變，從而使AMPK激活減少，PGC-1α作為AMPK下游效應分子表達下降，使得整個AMPK通過調節PGC-1α-核呼吸因子-1通路中激活編碼線粒體蛋白的核基因和線粒體DNA的轉錄復制異常，線粒體表達受到影響，內皮細胞修復功能受損[20-21]。另一方面AMPK、PGC-1α表達減少也導致其相應信號通路、合成代謝與分解代謝異常，生理性NO 的產生減少、炎性因子、caspase-3表達上升等自身防御機制異常，繼而導致血管內皮損傷。

綜上所述，本研究初步結果顯示，血糖波動對血管內皮細胞的損害程度高于持續高血糖，部分機制與其影響AMPK/PGC-1α相關通路及細胞能量代謝改變有關，確切機制值得進一步探討。