Neuropilin-1與胃癌發(fā)生、發(fā)展及血管生成的關(guān)系

胡希宏 王云忠 金桂龍 孫鑫鑫 盧淳考 王錦宏 李建宏

Neuropilin-1與胃癌發(fā)生、發(fā)展及血管生成的關(guān)系

胡希宏 王云忠 金桂龍 孫鑫鑫 盧淳考 王錦宏 李建宏

目的 探討胃癌組織中Neuropilin-1、VEGF的表達與胃癌生物學(xué)行為及血管生成的關(guān)系和意義。 方法 應(yīng)用免疫組化ElivisionTM法檢測正常胃黏膜、上皮內(nèi)瘤變、胃癌組織中Neuropilin-1、VEGF、CD34的表達并測定MVD，回顧分析胃癌患者的臨床病理資料。 結(jié)果 胃癌組織中Neuropilin-1、VEGF的表達及MVD高于正常胃黏膜和上皮內(nèi)瘤變組織，且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度密切相關(guān)。Neuropilin-1、VEGF表達陽性組的MVD高于各自陰性組。兩者表達呈正相關(guān)關(guān)系，聯(lián)合表達時MVD增高。 結(jié)論 Neuropilin-1、VEGF、血管生成參與了胃癌發(fā)生、浸潤與轉(zhuǎn)移；Neuropilin-1、VEGF參與了胃癌的血管生成；表達存在協(xié)同作用；聯(lián)合表達時血管生成的效應(yīng)增強。Neuropilin-1作為腫瘤抗血管治療的靶點具有一定的價值。

胃癌 Neuropilin-1 VEGF 微血管密度 血管生成 免疫組化

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，血管生成提供了胃癌生長和轉(zhuǎn)移的潛能。神經(jīng)纖毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）在神經(jīng)細胞導(dǎo)向、軸突生長方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，最近發(fā)現(xiàn)可作為血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的受體，在腫瘤血管新生方面發(fā)揮重要作用。本研究通過免疫組化法檢測組織中NRP-1、VEGF的表達及微血管密度（microvascular density，MVD），旨在探討NRP-1與胃癌發(fā)生、發(fā)展及血管生成的關(guān)系和意義。

1 材料和方法

1.1 材料 收集本院外科2008-01—12手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的進展期胃癌標本62例，其中男50例，女12例，年齡44～88歲，中位年齡65歲。同期胃鏡活檢標本54例，包括正常胃黏膜22例，胃上皮內(nèi)瘤變（gastric intraepithelial neoplasia，GIN）共32例，其中低級別上皮內(nèi)瘤變（low grade intraepithelial neoplasia，LGN）組織和高級別上皮內(nèi)瘤變（high grade intraepithelial neoplasia，HGN）組織各16例。胃癌分期按AJCC胃癌TNM分期（2010年第7版）標準。鼠抗人NRP-1單克隆抗體來自英國Abcam公司，鼠抗人VEGF、CD34單克隆抗體及ElivisionTM試劑盒均購于基因科技（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測 采用免疫組化ElivisionTM法。標本用甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。組織抗原修復(fù)后加一抗，依次加聚合物增強劑及酶標抗鼠/抗兔聚合物，0.05%DAB顯色。以PBS液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性片（公司提供）作為陽性對照。

1.2.2 陽性結(jié)果判斷標準 NRP-1、VEGF陽性染色信號為棕黃色或棕褐色顆粒，結(jié)果判定根據(jù)文獻報道采用半定量積分法[1]，對每張切片的陽性細胞著色強度及陽性細胞率分別進行分級計分。染色強度：不染色計0分；輕度染色（淡黃色）計1分；中度染色（黃色）計2分；強染色（棕黃色或黃褐色）計3分。陽性細胞率：選染色均勻區(qū)，在400倍視野下計數(shù)著色細胞占視野細胞總數(shù)的百分數(shù)，共計數(shù)5個視野，取平均值。陽性細胞率（0、＜25%、25%～50%、＞50%）分別計分為0、1、2、3。按上述兩項之和判斷結(jié)果：0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

1.2.3 MVD計數(shù) 參照 Weidner等[2]的方法：以血管內(nèi)皮細胞呈棕色或棕黃色染色為CD34陽性，微血管計數(shù)以被染成棕黃色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為1個血管計數(shù)。先低倍鏡（×40）下觀察，確定3個血管著色最密集的區(qū)域（熱點），然后在高倍鏡（×400）下計數(shù)這3個視野的微血管數(shù)，取其平均值為該片的MVD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher精確概率法。MVD以 表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。指標間的關(guān)系采用非參數(shù)Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 病變及正常胃黏膜中NRP-1、VEGF的表達及MVD比較 胃癌組織中NRP-1、VEGF表達主要位于癌細胞胞膜上和胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色的顆狀物質(zhì)，彌漫分布于整個胞質(zhì)或沿胞膜周邊呈線狀分布（圖1-4，見插頁）。NRP-1、VEGF陽性率及MVD在正常胃黏膜組＜上皮內(nèi)瘤變組＜胃癌組（均P＜0.05）。LGN組與HGN組的NRP-1、VEGF陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但MVD比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HGN組與胃癌組比較：NRP-1陽性率及MVD差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而VEGF陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 胃癌組織中NRP-1、VEGF的表達及MVD與臨床病理特征的關(guān)系 NRP-1、VEGF的表達及MVD：（1）在不同性別、年齡、腫瘤的部位及大小組別之間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；（2）在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、不同浸潤深度、不同TNM分期組別之間，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無轉(zhuǎn)移組；漿膜或漿膜外浸潤組高于未達漿膜層組；TNM分期Ⅲ+Ⅳ組高于Ⅰ+Ⅱ組。（3）NRP-1、VEGF表達陽性率在低、未分化組高于高、中分化組（均P＜0.05），而MVD差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 病變及正常胃黏膜中NRP-1、VEGF的表達及MVD比較（例）

2.3 胃癌組織中NRP-1、VEGF的表達與MVD的關(guān)系 NRP-1、VEGF表達陽性組的MVD高于各自陰性組（均P＜0.01），見表3。

2.4 胃癌組織中NRP-1、VEGF表達的相關(guān)性 NRP-1與VEGF共同陽性表達者占48.387%（30/62），表達強度呈正相關(guān)（r=0.286，P＜0.05）。

2.5 胃癌組織中NRP-1、VEGF的聯(lián)合表達與MVD的相關(guān)性 當(dāng)兩者聯(lián)合共同表達陽性時，其MVD高于任一種陽性表達以及高于兩者均表達陰性時（P＜0.05），見表4。

3 討論

1987年Takagi等[3]在非洲蟾蜍神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)了一種與神經(jīng)生長導(dǎo)向有關(guān)的細胞膜表面I型跨膜糖蛋白，稱為A5抗原。由于早期發(fā)現(xiàn)A5抗原在神經(jīng)纖維的特殊區(qū)域中表達，1995年Fujisawa等[4]將之命名為Neuropilin（NRP）。NRP有兩個亞型：NRP-1和NRP-2，它們結(jié)構(gòu)相似，約47%氨基酸序列同源。NRP-1由位于染色體10p12的112kb基因編碼，其開放閱讀框由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成[5]。最初研究顯示NRP為collapsin/ semaphorin家族受體，在神經(jīng)細胞導(dǎo)向、軸突生長方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，NRP可表達于內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞，作為VEGF165及與血管新生相關(guān)的其它幾種VEGF家族成員的受體，在腫瘤血管新生方面發(fā)揮重要作用。

表2 胃癌組織中NRP-1、VEGF的表達及MVD與臨床病理特征的關(guān)系

表3 胃癌組織中NRP-1、VEGF的不同表達與MVD的關(guān)系

在正常成人，NRP-1主要表達于內(nèi)皮細胞、骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞等。而許多腫瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌等，也有NRP-1的表達。Hansel等[6]研究發(fā)現(xiàn)：在消化道腫瘤發(fā)展過程中，隨著腺體的發(fā)育異常從低到高，癌前病變組織中NRP-1表達強度和范圍隨之增加，食管、胰腺、結(jié)直腸癌中NRP-1的表達水平與癌浸潤及轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)，提示NRP-1可能與消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Berge等[7]的肝癌靶基因治療研究發(fā)現(xiàn)：NRP-1在轉(zhuǎn)基因的肝癌小鼠肝臟中，隨疾病進展，NRP-1表達增加。Ghosh等[8]觀察到：NRP-1在乳腺癌早期病變中可能與腫瘤生長及進展有關(guān)，并且在乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用。胃癌通常需經(jīng)歷多年的癌前病變過程，胃上皮內(nèi)瘤變與胃癌關(guān)系密切，HGN與40%～100%早期胃癌相關(guān)，并見于5%～80%進展期胃癌的癌旁組織[9]。本研究發(fā)現(xiàn)：隨胃黏膜病變的進展，NRP-1表達率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且NRP-1的表達與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度存在密切相關(guān)性，提示NRP-1參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。

表4 NRP-1、VEGF聯(lián)合表達與MVD的關(guān)系

腫瘤新生血管的生成提供了腫瘤的失控、侵襲性生長和轉(zhuǎn)移的潛能，惡性腫瘤誘導(dǎo)血管生成的能力在一定程度上決定了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。MVD反映了腫瘤組織的血管生成狀態(tài)，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤血管生成的研究。腫瘤血管生成受多種血管生成因子和血管生成抑制物的調(diào)控，其中VEGF是中心調(diào)控因子。VEGF能直接促進血管生成并可增強血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，通過纖維蛋白溶解酶系統(tǒng)及金屬蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[10]。本研究表明：VEGF表達率與胃黏膜病變程度及胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度存在密切相關(guān)性，提示VEGF參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。而且MVD在正常胃黏膜、上皮內(nèi)瘤變、胃癌組織中呈遞增現(xiàn)象，表明在正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)變過程中，存在著大量的微血管生成，血管生成在胃癌的發(fā)生過程中起一定的作用。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜及漿膜外浸潤組的MVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無浸潤組，提示：腫瘤內(nèi)新生血管越豐富，越容易發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)NRP-1基因過度表達可促進腫瘤血管新生和腫瘤生長、遷移，是正向調(diào)節(jié)因子。Miao等[11]通過誘導(dǎo)前列腺癌細胞過度表達NRP-1，發(fā)現(xiàn)腫瘤顯著增大、內(nèi)皮細胞增殖、腫瘤毛細血管密度增加、血管擴張。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1是VEGF165的復(fù)合受體，其生物學(xué)功能主要與VEGF165和血管內(nèi)皮細胞表面受體（vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR）-2有關(guān)。Soker等[12]培養(yǎng)了單獨表達NRP-1、VEGFR-2以及協(xié)同表達NRP-1、VEGFR-2的內(nèi)皮細胞系，發(fā)現(xiàn)與單獨表達VEGFR-2的內(nèi)皮細胞相比，協(xié)同表達NRP-1、VEGFR-2可加強VEGF165與VEGFR-2的結(jié)合，增強VEGF165介導(dǎo)內(nèi)皮細胞趨化活性及有絲分裂原性。表明在內(nèi)皮細胞中NRP-1是作為VEGFR-2的協(xié)同受體而發(fā)揮作用的。體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞同時觀察到：只有在NRP-1存在的情況下，VEGF刺激所產(chǎn)生的細胞有絲分裂和內(nèi)皮細胞趨化性才存在[13]。當(dāng)VEGF165與NRP-1結(jié)合受到抑制時，VEGF165與VEGFR-2結(jié)合及其有絲分裂原活性也被抑制，可見NRP-1是通過調(diào)節(jié)VEGF與VEGFR-2結(jié)合及其生物活性而影響VEGF誘導(dǎo)的血管形成的[14]。Murga等[15]研究認為，在同一內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞上NRP-1和VEGFR-2之間形成以VEGF165為中心的橋聯(lián)結(jié)構(gòu)，拉近了彼此間的距離，從而增強了VEGF的結(jié)合能力及功能活性。本研究結(jié)果顯示：NRP-1陽性表達組的MVD顯著高于陰性組，表明NRP-1在胃癌的血管生成中起到促進作用。而且胃癌組織中NRP-1與VEGF共同陽性表達者占48.387%，表達強度呈正相關(guān)。且共同陽性表達組的MVD顯著高于其它組，表明NRP-1和VEGF聯(lián)合表達時增強了促血管生成的效應(yīng)，提示NRP-1可以放大VEGF的促血管生成的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，筆者認為NRP-1基因的過度表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為評價胃癌生物學(xué)行為的指標之一。同時，NRP-1可以增強VEGF的生物學(xué)作用，促進胃癌的血管生成，NRP-1作為腫瘤抗血管治療的靶點具有一定的價值。本研究通過免疫組化法從形態(tài)學(xué)的角度在蛋白水平對NRP-1、VEGF與胃癌的關(guān)系及相互之間的關(guān)系進行了初步探討，今后還需從基因水平進行深入研究，以更深層次地揭露這些環(huán)節(jié)和規(guī)律。

[1] Brekken R A,Thorpe P E.Vascular endothelial growth factor and vascular targeting ofsolid tumors[J].Anticancer Res,2001,21(6B): 4221-4229.

[2] Weidner N,Semple J P,Welch W R,et al.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma[J].N Engl J Med,1991,324(1):1-8.

[3] Takagi S,Tsuji T,Amagai T,et al.Specific cell surface labels in the visual centers of Xenopus laevis tadpole identified using monoclonal antibodies[J].Dev Biol,1987,122(1):90-100.

[4] Fujisawa H,Takagi S,Hirata T.Growth-associated expression of a membrane protein,neuropilin,in Xenopus optic nerve fibers[J]. Dev Neurosci,1995,17(5-6):343-349.

[5] Rossignol M,Gagnon M L,Klagsbrun M.Genomic organization of human neuropilin-1 and neuropilin-2 genes:identification and distribution of splice variants and soluble isoforms[J].Genomics, 2000,70(2):211-222.

[6] Hansel D E,Wilentz R E,Yeo C J,et al.Expression of neuropilin-1 in high-grade dysplasia,invasive cancer,and metastases of the human gastrointestinal tract[J].Am J Surg Pathol,2004,28(3): 347-356.

[7] Berge M,Allanic D,Bonnin P,et al.Neuropilin-1 is upregulated in hepatocellular carcinoma and contributes to tumour growth and vascular remodelling[J].Hepatol,2011,55(4):866-875.

[8] Ghosh S,Sullivan C A,Zerkowski M P,et al.High levels of vascular endothelial growth factor and its receptors(VEGFR-1, VEGFR-2,neuropilin-1)are associated with worse outcome in breast cancer[J].Hum Pathol,2008,39(12):1835-1843.

[9] 李嬡,常曉燕,陳杰.胃上皮內(nèi)瘤變分類及形態(tài)學(xué)探討[J].中華病理學(xué)雜志,2010,39(7):492.

[10] Fondevila C,Metges J P,Fuster J,et al.p53 and VEGF expression are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative resection of gastric cancer[J].Br J Cancer,2004,90(1):206-215.

[11] Miao H Q,Lee P,Lin H,et al.Neuropilin-1 expression by tumor cells promotes tumor angiogenesis and progression[J].FASEB J,2000,14(15):2532-2539.

[12] Soker S,Takashima S,Miao H Q,et al.Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor[J].Cell,1998,92 (6):735-745.

[13] West D C,Rees C G,Duchesne L,et al.Interactions of multiple heparin binding growth factors with neuropilin-1 and potentiation of the activity of fibroblast growth factor-2[J].J Biol Chem, 2005,280(14):13457-13464.

[14] Neufeld G,Cohen T,Gengrinovitch S,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors[J].FASEB J,1999,13(1): 9-22.

[15] Murga M,Fernandez-Capetillo O,Tosato G.Neuropilin-1 regulates attachment in human endothelial cells independently of vascular endothelial growth factor receptor-2[J].Blood,2005, 105(5):1992-1999.

Correlation of Neuropilin-1 expression with tumor progression and angiogenesis in human gastric carcinoma

HU Xihong，WANG Yun-

zhong，JIN Guilong，et al. Department of Surgery，Dongyang People’s Hospital，Dongyang 322109,China

【 Abstract】Objective To investigate the expression of Neuropilin-1 (NRP-1)and vascular endothelial growth factor (VEGF)in gastric carcinoma tissue,and to examine their relationship with tumor angiogenesis and biological behavior of gastric carcinoma. Methods The expression of NRP-1，VEGF and CD34 was detected with ElivisionTMimmunohistochemical method and the microvascular density(MVD)was also assessed in surgical or biopsy tissue specimens of gastric carcinoma(GC),gastric intraepithelial neoplasia(GIN)and normal gastric mucosa(NG)．The correlation of histochemical results with clinicopathology was analyzed. Results The positive expression of NRP-1,VEGF and CD34 in GC were significantly higher than that in NG and GIN;their expression and MVD were closely correlated with lymph node metastasis and depth of invasion.The MVD in patients with NRP-1 and VEGF positive-expression was significantly higher than that in patients with negative-expression.There was positive correlation between the expression of NRP-1 and VEGF in gastric carcinoma.MVD was increased significantly when NRP-1 and VEGF were co-expressed. Conclusion The results indicate that expression of NRP-1，VEGF may be involved in angiogenesis and tumor progression of human gastric carcinoma,and NRP-1 may be the potential therapeutic target．

Gastric carcinoma Neuropilin-1 VEGF Microvascular density Angiogenesis Immunohistochemistry

2012-09-03）

（本文編輯：胥昀）

金華市科技計劃項目（2009-3-015）

322109 東陽市人民醫(yī)院外科