腫瘤干細胞標志CD166在結腸癌中的表達及其臨床生物學意義

張鈞書 王科 黃建

腫瘤干細胞標志CD166在結腸癌中的表達及其臨床生物學意義

張鈞書 王科 黃建

目的探討腫瘤干細胞標志CD166在原發結腸癌組織中的表達及其臨床生物學意義。方法收集57例患者的原位結腸癌組織，應用免疫組織化學檢測其CD166表達。應用流式細胞分選（FACS）技術，以CD166/CD133標志分選結腸癌細胞株SW620，通過NOD/SCID小鼠脾臟移植，觀察肝轉移情況。結果CD166可表達于結腸癌細胞的細胞質和細胞膜，其中細胞質陽性率98.2%（56/57），細胞膜陽性率42.1%（24/57）。膜CD166陽性表達與局部浸潤（P=0.010）、pTNM分期（P=0.035）、遠處轉移（P=0.013）、年齡（P=0.026）相關；而與性別（P=0.426）、淋巴結轉移（P=0.104）、腫瘤分化（P=0.171）無相關性。Log-rank生存分析顯示：結腸癌細胞膜CD166陽性表達與患者生存期（P=0.014）呈負相關。動物實驗的初步結果顯示：脾包膜接種CD166陽性的SW620細胞可形成肝轉移灶。結論CD166陽性表達與腫瘤局部進展和遠處轉移有關，是判斷預后不良的標志，CD166陽性的腫瘤細胞可能具有肝轉移潛能。

結腸癌 CD166 CD133 預后 肝轉移

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第二位，發病率有逐年上升的趨勢[1]。由于早期無癥狀，相當數量的患者發現腫瘤時已處于中晚期，從而導致治療效果不佳，外科手術和放、化療均不能徹底根除體內存留的腫瘤細胞[2]。目前大部分研究結果顯示腫瘤組織中存在極少數具有無限增殖和自我更新能力，可導致腫瘤發生的細胞，即腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）。CSC可能是腫瘤發生、轉移、復發和耐藥的主要因素[3-4]，近年來已成為腫瘤的研究熱點，CSC分子標志物表達在治療選擇和預后判斷上具有重要意義。研究顯示CD166可能是結腸癌干細胞標志之一，本研究通過免疫組織化學檢測結腸癌組織CD166的表達，了解其與腫瘤浸潤、轉移和預后的關系；并以CD166標志分選結腸癌細胞株SW620，移植入NOD/SCID小鼠脾臟，觀察其肝轉移的能力。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2007-01—2010-01在浙江省臨安市人民醫院手術的57例結腸癌患者的石蠟標本，經浙江大學附屬第二醫院病理科醫師確診，所有患者術前未接受放、化療，臨床病理資料完整。其中男37例，女20例，年齡33～86歲，平均64.5歲。病變部位左半結腸34例，右半結腸23例。按全國結直腸癌協作組標準進行組織學分類，其中高分化7例、中分化28例、低分化22例。浸及漿膜和漿膜外組織54例，未超過肌層3例。有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移32例。TNM分期參照美國癌癥聯合會癌癥分期手冊2010年第7版，Ⅰ期3例、Ⅱ期27例、Ⅲ期20例、Ⅳ期7例。57例中失訪5例，死亡12例。18例遠處轉移，依次是肝臟、腹腔、腹膜、肺，其中肝轉移10例。

1.2 實驗動物 5周齡雄性NOD/SCID小鼠，體重20g左右，購自中科院上海動物實驗中心，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心無特殊病原體（specific pathogen free,SPF）級動物房。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗人 CD166濃縮型單克隆抗體（工作液濃度1∶50），購自英國abcam公司；即用型免疫組化試劑盒（SP-9000）,購自福州邁新生物有限公司。人結腸腺癌細胞SW620，由浙江大學腫瘤研究所提供。流式分選用鼠抗人CD166單克隆抗體、PE羊抗鼠免疫球蛋白均購自美國BD公司；CD133/2(AC14l)-FITC熒光抗體購于德國Miltenyin公司；流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學檢測結腸癌組織中CD166表達具體操作按試劑盒說明書進行，DAB顯色。結果判斷：細胞膜和細胞質分別判斷，出現黃色顆粒為陽性，計算陽性細胞占視野細胞數的百分比，陽性細胞數＜10%為陰性，10%～49%為+，50%～74%為++，＞75%為+++。并請2位病理科醫師雙盲確認。

1.4.2 細胞培養及分選 人結腸癌細胞株SW620采用RPMI1640完全培養液，在37℃、5%CO2孵箱中貼壁培養。收集2×106個細胞，用冷的PBS 2ml洗滌1次后，以含2%FBS的PBS封閉10min，分成5管（CD133、CD166、CD133/CD166、對照、空白）。加入一抗后，冰上避光放置30min，洗滌去掉未結合的一抗。加入熒光標記的二抗，冰上避光放置10min后，洗滌兩次。取500μl細胞懸液上流式細胞儀分析。同時準備3μl無血清培養液用于細胞分選。

1.4.3 動物實驗 采用0.5%的戊巴比妥鈉50mg/kg，小鼠腹腔內注射麻醉，麻醉成功后用膠布將小鼠固定于手術臺上。皮膚消毒后左側肋緣下行0.5～1cm切口，進腹后找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1ml注射器從脾下極進針，將瘤細胞液0.1ml注射于脾內，拔針后，酒精棉球按壓針眼，輕輕按揉脾臟5min，使瘤細胞經脾靜脈進入肝臟，注射區蒼白隆起消失后，結扎脾血管及胃短動、靜脈，切除脾臟并關腹。麻醉清醒后常規飼養。定期觀察小鼠的一般狀況。所有小鼠飼養至自然死亡或至第8周行頸椎離斷法處死。解剖后觀察有無肝臟及其他部位轉移，取出肝臟及有轉移的組織,以4%甲醛固定。石蠟包埋后切片，HE染色。

1.5 統計學處理 采用2.15.0版R統計軟件，計量資料以表示。計數資料用χ2檢驗及Spearman等級相關分析，對生存數據進行Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應用Log-rank檢驗差異性。

2 結果

2.1 結腸癌組織中CD166表達 免疫組化結果提示57例結腸癌組織中細胞質表達陽性率為 98.2%（56/ 57），細胞膜陽性表達率為42.1%（24/57）（圖1，見插頁）。

2.2 結腸癌細胞膜CD166表達與臨床病理學特征的關系 本研究結果顯示年齡≥65歲的患者結腸癌組織 CD166陽性率明顯高于＜65歲者（P＜0.05）。CD166陽性表達亦與浸潤深度有關，T3、T4患者CD166陽性率明顯高于T1、T2患者（P＜0.05），CD166陽性表達還與結腸癌遠處轉移和TNM分期有關（均P＜0.05）。而與性別、分化程度、淋巴結轉移無關（均P＞0.05），見表1。

2.3 結腸癌細胞膜CD166表達與患者預后的關系Kaplan-Meier生存分析發現CD166陰性表達患者生存時間明顯高于陽性患者（P＜0.05），相對風險0.23（95%可信區間0.0724～0.741），見圖2。

2.4 SW620細胞流式分選結果 以CD166/CD133為標志，分選SW620細胞得出CD166+/CD133+的SW620細胞占 27.7%，CD166+/CD133-細胞 16.8%，CD166-/ CD133+細胞33.8%，而CD166-/CD133-細胞21.6%。

2.5 NOD/SCID小鼠肝臟轉移結果 脾包膜注射2×106個未分選SW620細胞和2×105個CD166-細胞的小鼠未出現肝轉移（0/2、0/1、0/1），而注射2×105個CD166+/ CD133+和CD166+/CD133-細胞可發生肝轉移（3/3、2/3）（圖3，見插頁）。

表1 結腸癌細胞膜CD166表達與臨床病理特征關系[例（%）]

圖2 結腸癌CD166表達與患者生存曲線

3 討論

近年來，CSC已成為腫瘤研究的熱點之一，在結直腸癌細胞中首先發現了一些CD133陽性的細胞，其所占比例很小，但是有很強的增殖能力，具有CSC特征。隨著研究的深入，陸續發現了CD44、EpCAM、CD166等結直腸癌CSC的標志物[5-6]。研究證實一些CSC標志物與腫瘤臨床指標相關，如目前已發現CD133、CD26等CSC的分子標志與其肝轉移相關，其高表達提示結腸癌預后不良[7-12]。而CD166分子在結腸癌中的表達和生物學意義研究報道不多且有爭議，需進一步研究闡明。

CD166（ALCAM）是分子量為65KDa細胞黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族。在活化的白細胞、神經細胞、上皮細胞和血液前體細胞中存在生理性表達[13]。在腫瘤組織中，首先發現CD166是惡性黑色素瘤疾病進展有價值的預后判斷指標[14-15]。近來有學者報道在結腸癌中細胞膜CD166表達與腫瘤進展密切相關，是預后不良的判斷指標[16-17]。但Lugli等[18]應用免疫組織化學檢測發現胞膜不表達CD166、CD44的結腸癌細胞具有更高浸潤性和淋巴轉移率，與生存期降低相關。本研究顯示結腸癌細胞質CD166陽性表達98.2%，但生物功能及意義尚不清楚。在結腸癌細胞膜陽性表達42.1%，并與腫瘤浸潤、遠處轉移呈正相關，陽性患者生存期較陰性者降低，并具有統計學差異。而與淋巴結轉移和腫瘤分化無關，但需更多病例數證明。Patel等[19]研究發現CD44、CD166膜陽性細胞局限分布于腺管周圍，并隨著年齡的增長，CD44、CD166的表達更加強。本研究也顯示在高齡結腸癌患者CD166陽性表達增加，其原因尚不清楚。

CD166已知作為CD6的配體參與上皮細胞間的黏附作用[20]。在部分結腸腺瘤和結腸癌細胞膜上表達，可能通過同嗜性和異嗜性黏附介導細胞與細胞的相互作用，參與機體多種病理生理過程，在腫瘤的進展，主要是在腫瘤的轉移過程中可能起重要作用。免疫組織化學研究發現，結腸癌細胞膜CD166陽性患者具有更高轉移發生率，主要是肝轉移。為進一步驗證CD166陽性結腸癌細胞轉移能力，筆者以CD166和CD133為標志應用FACS技術分選結腸癌細胞SW620，經脾移植NOD/ SCID小鼠觀察肝轉移情況，并與未分選SW620細胞比較。初步結果顯示CD166+細胞比未分選或CD166-細胞具有更強的肝轉移能力，推測CD166可能是獨立的轉移預測的標志。

總之，本研究提示在結腸癌中CD166+細胞具有較強的轉移能力，CD166可能是腫瘤預后的新標志物和治療的潛在靶點，尚需積累更多病例，進一步體內外研究證明。

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Expression of CD166 in colon cancer and its biological significance

ObjectiveTo investigate the expression and biological significance of CD166 in primary colon cancer.MethodsThe expression of CD166 was detected by immunohistochemistry in tissue specimens from 57 patients with colon cancer of various pTNM stages.Human colon cancer SW620 cells were screened for positive expression of CD166 and CD133.The CD166 and CD133-positive SW620 cells were inoculated in spleen of NOD/SCID mice;then the ability of liver metastases of transplanted SW620 tumors was evaluated.ResultsThe CD166 was positively expressed in cytoplasm and membrane of colon cancer cells, being 98.2%(56/57)in cytoplasm and 42.1%(24/57)in membrane of cancer cells.CD166 membrane expression was significantly associated with older age(P=0.026),tumor stage(P=0.035),and distance metastasis(P=0.013),not with gender(P=0.426),lymph node metastasis(P=0.104)and tumor differentiation(P=0.171).Log-rank survival analysis revealed that CD166 membrane expression was negatively correlated with the survival of patient(P=0.014).The results of the animal experiments demonstrated metastatic growth in the liver after splenic capsule injection CD166+SW620 cells.ConclusionThe expression of membrane CD166 is associated with poor clinical outcome and short survival in the patient with colon cancer.CD166+colon cancer cells may have a potential of liver metastasis.

Colon cancerCD166 CD133 Prognosis Liver metastases

2012-12-04）

（本文編輯：胥昀）

教育部博士點基金資助項目（20100101110124）

310009 杭州，浙江大學醫學院附屬第二醫院腫瘤外科（張鈞書、王科、黃建，張鈞書系在職碩士研究生，現在臨安市人民醫院普外科工作）

張鈞書，E-mail：zhjunshu@163.com