馬凡綜合征患兒原纖維蛋白-1基因突變篩查的研究

關欣亮，田小麗，謝進生

馬凡綜合征(MFS)是15號染色體的原纖維蛋白-1基因(FBN1)缺陷導致的常染色體顯性遺傳性全身結締組織病變，最早是由法國兒科醫生Marfan在100多年前提出[1]。MFS患者臨床表現各異，發病率為1/5 000～1/10 000，主要累及骨骼、心血管、眼睛等系統，約25%的患者是自發突變，缺乏家族史[2-3]。FBN1定位于15q21.1，包括65個外顯子，長度約為235 kb，編碼一種分子量為230 kDa的糖蛋白——原纖維蛋白-1，而原纖維蛋白-1是細胞外基質微纖維的重要組成部分，因此FBN1突變影響了微纖維的結構與功能[4-8]。至今已發現超過800余種的FBN1突變。FBN1由3種富含半胱氨酸的結構域組成：(1)47個表皮生長因子樣結構域(EGF結構域)，其中43個EGF結構域含有鈣結合共有序列，可與鈣離子結合稱為鈣結合表皮生長因子樣結構(cbEGF結構域)；(2)潛在的轉化生長因子β1結合蛋白結構域(LTBP結構域)；(3)雜交分子結構域(hybrid motif結構域)[1，3-4，8-11]。近來由于分子生物學和遺傳學領域的進展，分析FBN1突變對早期診斷、遺傳咨詢及對MFS及其類似疾病的認識具有極為重要的意義。由于MFS是一種進展性心血管疾病，一部分患兒隨年齡增大癥狀才逐漸明顯，臨床表現個體差異很大，早期癥狀不典型，且缺乏特異性，加之大部分患兒無家族史，因此MFS患兒的診斷存在一定的特殊性。而我國對FBN1與MFS的研究還處于落后階段，尤其對MFS患兒的早期診斷經驗不足。單鏈構象多態性(SSCP)分析是目前應用最廣泛的檢測基因突變的方法之一。為此，本研究應用聚合酶鏈式反應(PCR)-SSCP和DNA測序技術對MFS患兒進行FBN1突變篩查。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇我院2010年1月—2011年12月心外科病房收治的MFS患兒8例，年齡均<18歲，符合1996年MFS的Ghent診斷標準[6]。

1.2方法

1.2.1DNA提取抽取2 ml外周靜脈血，置EDTA抗凝管，用全血基因組DNA抽提試劑盒(QIAGEN 公司)提取DNA。

1.2.2PCRFBN1的65個外顯子的PCR擴增引物分別設計在外顯子兩側的內含子區域。FBN1的PCR擴增引物由北京大學分子醫學研究所的田小利教授惠贈。其中，FBN1的第21號外顯子的PCR擴增引物：上游引物：5′-ATATTATTCCCTCCTCTGCAG-3′，下游引物：5′-GTGGTATAGGAACCACAG-3′。第27號外顯子的PCR擴增引物：上游引物：5′-CCCACCTTTAACATGGTCATT-3′，下游引物：5′-GAAAGTCTTTGCTCCTTACC-3′。第30號外顯子的PCR擴增引物：上游引物：5′-CAACAACCTGTGGTGTTGG-3′，下游引物為：5′-CAACAACCTGTGGTGTTGG-3′。

PCR反應體系：10×Buffer 2 μl〔含氯化鎂(MgCl2) 10 mmol/L〕，2×dNTP 2 μl (2 mmol/L),上下游引物共2 μl(10 mmol/L)，DNA模板1 μl (1 mmol/L)，Taq plus Ⅰ DNA聚合酶0.5 μl(510 U/L)，加雙蒸水至100 μl。95 ℃變性1 min進入循環。95 ℃ 30 s，退火30 s，退火溫度50～70 ℃(不同外顯子、不同溫度)。72 ℃延伸30 s，共30個循環。最后72 ℃ 再延伸7 min。

1.2.3電泳鑒定DNA取擴增產物5 μl在2%瓊脂糖凝膠電泳后進行溴化乙錠(EB)染色，同時加Marker標記DNA相對分子質量進行電泳檢測。

1.2.4SSCP分析硅化玻璃板后玻璃板傾斜45°灌膠，倒入新鮮配制的0.5×TBE Buffer。行300 V預電泳30 min。將5 μl PCR樣品與10 μl Loading Buffer混合，水浴鍋 96 ℃變性5 min，置冰上5 min。電壓300 V，層析柜中電泳，300 bp電泳8 h。置于脫色搖床45 r/min，固定30 min，超純水洗2次，置于脫色搖床45 r/min，5 min/次。將膠放入新鮮染色液中，置于脫色搖床45 r/min，染色80～90 min。盛超純水，置于脫色搖床45 r/min，膠放入洗10 s后立即取出。將膠放入新鮮配制預冷的顯色液中，觀察其顯色，轉速可調高至100 r/min。條帶出現后將膠取出，棄顯色液，盛固定液，固定液固定7 min，超純水洗凈。

1.2.5PEG純化SSCP分析現有變異帶時，則將該PCR產物純化待用。聚乙二醇(PEG)純化：將DNA轉入EP管中，加入等體積30%聚甲基丙烯酸甲酯(PM)，冰上10 min，vortex；13 000 r/min，4 ℃，20 min離心，棄上清；加入100 ml預冷75%乙醇，13 000 r/min，4 ℃，5 min，離心，棄上清；空干，加入20 ml重蒸餾水(ddH2O)。

1.2.6DNA測序與FBN1突變數據庫(http://www.umd.be/FBN1/)[9]及正常人FBN1的DNA進行比對，應用全自動分析儀(ABI377型)對SSCP發現異常條帶的PCR產物進行DNA測序，以確定突變位點及類型。每個突變均重復3 次。

2　結果

2.1一般資料8例MFS患兒中男女各4例；年齡1～13歲,平均(7.8±4.2)歲；家族史陽性3例(37.5%)；身高(136.5±29.6)cm，體質量(29.9±17.1)kg；心功能Ⅰ級3例，Ⅱ級1例，Ⅲ級3例，Ⅳ級1例(見表1)。6例患兒行心臟手術，其中2例行帶主動脈瓣人工血管升主動脈替換術(Bentall術)；1例行左房室瓣+主動脈瓣雙瓣置換術(DVR術)+ “背心式”人工血管包裹術(Robicsek術)+房間隔缺損修補術(ASD修補術)，后因急性左心衰竭、呼吸衰竭死亡；1 例行主動脈瓣置換術(AVR術)+Robicsek術+左房室瓣成形術(MVP術)+右房室瓣成形術(TVP術)；1例行保留無冠竇同種瓣置換+Robicsek術；1例行Robicsek術。手術平均年齡為(8.6±1.0)歲。術后平均隨訪(9.3±2.7)個月，隨訪期間無死亡，心功能均為Ⅰ級，生活質量明顯改善。二次手術2例，1例Robicsek術后竇部擴張出現呼吸困難等壓迫癥狀行二次Bentall術，另1例行保留無冠竇同種瓣置換+Robicsek術，后因瓣膜毀損行AVR術。所有患兒術后未發生感染、出血和血栓等并發癥。

2.28例患兒中3例SSCP電泳有變異DNA條帶。然后分別進行DNA測序，并與FBN1突變數據庫及正常人FBN1的DNA進行對比。發現2例錯義突變和1例終止密碼突變(PTC突變)或稱為移碼突變。病例6 PTC突變(移碼突變)位于16號cbEGF結構域的30號外顯子第3 775位插入一堿基A產生移碼突變，最終在1 267位形成TGA終止密碼子。病例7是位于第13號cbEGF結構域的27號外顯子第3 349位發生T→C置換TGT>CGT導致第1 117位的半胱氨酸Cys>精氨酸Arg。病例8錯義突變位于第2個雜交分子的21號外顯子的第2 638位發生G→A置換GGT>AGT，導致第879 位甘氨酸Gly>絲氨酸Ser(見表2)。

3　討論

本研究中1例錯義突變c.2638G>A，位于21號外顯子的第2個雜交分子結構域，導致了第879位甘氨酸Gly被絲氨酸Ser替換。檢索各大數據庫，此突變國內外均未報道，考慮是MFS新發錯義突變。此例突變發生在第2個雜交分子結構域，在MFS數據庫里很少有突變涉及雜交分子結構域[12]。此例突變沒有影響到半胱氨酸殘基，但是此位置的甘氨酸是高度保守的氨基酸，可能通過顯性負效應影響了半胱氨酸對微纖維的組裝，影響了蛋白質二級結構，因此導致了MFS，但由于cbEGF結構域之間仍存在一定的鈣連接，所以患者癥狀相對較輕，發病較晚[5]。有研究顯示影響非半胱氨酸殘基的患者與影響半胱氨酸殘基的患者相比，在晶狀體脫位的發生率上明顯降低，影響半胱氨酸的錯義突變與晶狀體脫位有一定相關性，正常的半胱氨酸殘基和二硫鍵在晶狀體懸韌帶的結構完整性上起重要作用，這點在本研究也得到了證實[8，13-16]。

本研究發現1例已知新生兒馬凡綜合征(Neonatal MFS)，位于27號外顯子的第13號cbEGF結構域，為c.3349T>C，導致第1 117位的半胱氨酸Cys被精氨酸Arg替換。至今，FBN1的基因型-表型關系的研究顯示發生在24～32號外顯子的突變與Neonatal MFS密切相關[8]。Neonatal MFS與其他外顯子突變的患兒相比，發病年齡早，脊柱側凸，左房室瓣異常，升主動脈擴張和晶狀體脫位的發生率更高，且生存率低，與本研究結果相似[8，12]。22%的Neonatal MFS在兒童時期發病，僅有76%存活到40歲，而在其他外顯子僅有0.6%的患兒在兒童時期發病，98%的患兒能存活到40歲[8]。這種嚴重的MFS可能因為24～32號外顯子位于cbEGF結構域的中心位置，對于微纖維的分配和穩定起著更加重要的作用[8]。

在FBN1突變數據庫中，2/3的突變都是錯義突變，其中大部分突變發生在cbEGF結構域，且多數影響半胱氨酸殘基。有研究顯示半胱氨酸殘基缺失，與引入一個新的半胱氨酸殘基相比，會產生更嚴重的結構破壞，此例患者相對發病早，且病情嚴重[5，13]。過多或過少的半胱氨酸殘基干擾了對維持結構和鈣結合至關重要的3個二硫鍵，不易形成穩定的反向平行β折疊結構，進而破壞FBN1或微纖維的空間構象，影響了蛋白質的二級結構；同時二硫鍵的喪失將直接影響cbEGF結構域的空間構象，使其結合鈣的能力下降，進而降低了兩個相鄰cbEGF結構域的穩定性，導致蛋白水解性增高和原纖維蛋白-1的異常功能[4，6，8，12-14，17]。

表1　8例MFS患兒的臨床特點

表2　3例MFS患兒的基因突變

另有1例是國內外均未報道的新發PTC突變(移碼突變)，位于30號外顯子的第16號cbEGF結構域，即c.IVS30+1A>G，第3 775位插入堿基A使1 259位GGA>AGG，導致甘氨酸Gly>精氨酸Arg，最終在1 267位形成TGA終止密碼子。雖然目前FBN1突變與表型沒有可靠的證據，但據文獻報道PTC突變與Neonatal MFS關系密切，傾向于引起嚴重的骨骼畸形和心血管異常，但晶狀體脫位的發生率較低[8，18]。PTC突變由于形成不完全的蛋白質，通過顯性負效應干擾正常蛋白的聚合或者由于產生大量無活性的蛋白質減少了FBN1的總數量而導致MFS(單倍劑量不足)[8，15]。

1989年問世的PCR-SSCP是一種基于DNA構象差別來檢測突變的方法，是目前廣泛使用的一種基因突變檢測技術。應用PCR-SSCP-DNA測序方法可以檢測出MFS患兒FBN1的雜合突變。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，具有較高的敏感性，可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變，經實驗證明<300 bp的DNA片段中的單一堿基的變化，90%可被SSCP發現。本研究中3例存在異常電泳帶，經DNA測序均發現FBN1突變。與其他基因突變篩選方法相比，雖然其也有不足之處，但是該方法具有靈敏度高、特異性強、成本低廉等優點，能為MFS基因診斷提供依據。

4　結論

本研究發現了2例國內外均未報道的新發突變，1例是新發錯義突變，c.2638G>A，位于21號外顯子的第2個雜交分子結構域，導致了第879位甘氨酸Gly變為絲氨酸Ser；另1例是新發PTC突變(移碼突變)，c.IVS30+1A>G，位于30號外顯子的第16號cbEGF結構域，第3 775位插入堿基A使1 259位GGA>AGG，導致甘氨酸Gly>精氨酸Arg，最終在1 267位形成TGA終止密碼子，這2種突變可能是MFS的致病原因。

本研究同時發現1例已知Neonatal MFS的錯義突變，位于27號外顯子的第13號cbEGF結構域，為c.3349T>C，導致第1 117位的半胱氨酸Cys變為精氨酸Arg。

PCR-SSCP-DNA測序方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，具有敏感度高、特異性強、成本低廉等優點，能為兒童MFS基因診斷提供依據，是一種具有廣泛前途的檢測方法。

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