IgA腎病腎功能損害患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性研究

尤燕舞，楊發(fā)奮，林 栩，王 潔

IgA腎病是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病，占原發(fā)性腎小球疾病的40%以上，大多數(shù)患者病程呈慢性進(jìn)展，是導(dǎo)致終末期腎臟病的最常見病因，腎功能損害是IgA腎病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素之一。IgA腎病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為遺傳因素在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]。目前仍無針對IgA腎病的特異性治療，但血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑治療IgA腎病的療效是得到公認(rèn)和肯定的。本研究旨在探討IgA腎病腎功能損害患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的3個(gè)主要基因，即血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)基因A1166C、血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)和血管緊張素原(AGT)基因M235T的多態(tài)性。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2010年6月—2012年7月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和百色市人民醫(yī)院確診的IgA腎病患者68例為腎病組，其中男36例，女32例；平均年齡為(33.6±12.5)歲；患者均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)鏡下或肉眼血尿，伴或不伴蛋白尿，腎活檢后免疫病理明確IgA或以IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)彌漫沉積，尿蛋白定量56.3～1 628.5 mg/24 h，腎小球?yàn)V過率(GFR)48～126 ml/min；排除其他腎小球疾病患者。根據(jù)GFR將腎病組分為腎功能損害組4例(GFR<70 ml/min)和無腎功能損害組64例(GFR≥70 ml/min)。選取2012年7月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢且性別、年齡與腎病組患者相似的健康人70例為對照組，其中男34例，女36例；平均年齡為(31.5±10.8)歲，相互間無血緣關(guān)系，血常規(guī)、血脂及其他生化指標(biāo)均在參考值范圍內(nèi)，心電圖檢查正常。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取采集受檢者靜脈血3 ml，用乙二胺四乙酸鹽(EDTA-K2)抗凝，采用改良碘化鈉法提取白細(xì)胞基因組DNA，-86 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2AT1R基因A1166C多態(tài)性檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)。PCR反應(yīng)引物序列為A1166C-F：5′-CTCATCCACCAAGAAGCCT-3′，A1166C-R：5′-AGAAAAGTCGGTTCAGTCCA-3′。在15.0 μl的反應(yīng)體系中含50 pmol/μl引物各0.2 μl、1.5 μl的10×buffer、0.3 μl的2.5 Mm dNTP、0.1 μl的5 U Taq酶、1.2 μl MgCl2，在PCR擴(kuò)增儀上按以下條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、68 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，20個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸6 min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，37 ℃用DdeⅠ水解過夜。3%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓150 V，電泳液為1×TBE)，溴酚藍(lán)染色30 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3ACE基因I/D多態(tài)性檢測采用直接PCR法，ACE基因第16內(nèi)含子中存在的缺失(D)和插入(I)多態(tài)性表現(xiàn)為缺失純合子(DD)、插入純合子(II)以及缺失和插入雜合子(DI)3種基因型。PCR反應(yīng)引物序列為hACE-F：5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′，hACE-R：5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′。在15.0 μl的反應(yīng)體系中含50 pmol/μl引物各0.2 μl、1.5 μl的10×buffer、0.3 μl的2.5 Mm dNTP、0.1 μl的5 U Taq酶、1.2 μl MgCl2，在PCR擴(kuò)增儀上按以下條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性300 s，95 ℃變性30 s、68 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，20個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸6 min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓150 V，電泳液為1×TBE)，溴酚藍(lán)染色30 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.4AGT基因M235T多態(tài)性檢測采用PCR-RFLP，PCR反應(yīng)引物序列為rs699-F：5′-GAAGACTGGCTGCTCCCTCA-3′，rs699-R：5′-TCAGCTACACATTGGATACTAAGTC-3′。在15.0 μl的反應(yīng)體系中含50 pmol/μl引物各0.2 μl、1.5 μl的10×buffer、0.3 μl的2.5 Mm dNTP、0.1 μl的5 U Taq酶、1.2 μl MgCl2，在PCR擴(kuò)增儀上按以下條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性300 s，95 ℃變性30 s、68 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s，20個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，20個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸6 min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，37 ℃用Hin1Ⅱ酶水解過夜。3%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓150 V，電泳液為1×TBE)，溴酚藍(lán)染色30 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.5基因測序取不同基因型的酶切產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物各30 μl送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，以證實(shí)與酶切鑒定的基因型結(jié)果是否一致。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算各組AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型頻率，確認(rèn)其是否符合Hardy-Weinberg平衡公式P2+2Pq+q2=1(P為AA或II或MM基因型頻率，q為CC或DD或TT基因型頻率，Pq為AC或ID或MT基因型頻率)。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因型頻率AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.2電泳結(jié)果AT1R基因A1166C基因型可見188 bp的等位基因1166A片段(切點(diǎn)消失)，等位基因1166C片段(切點(diǎn)存在)呈130 bp和58 bp兩個(gè)片段(見圖1A)；ACE基因I/D基因型可見D等位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為190 bp，I等位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為490 bp(見圖1B)；AGT基因M235T基因型有3種：純合子MM只見1條173 bp電泳帶，純合子TT可見133 bp和40 bp兩條電泳帶，雜合子MT可見173 bp、133 bp和40 bp共3條電泳帶(見圖1C)。

2.3基因型分布腎病組與對照組ACE基因I/D基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組AT1R基因A1166C、AGT基因M235T基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.4基因測序結(jié)果AT1R基因A1166C的AA和CC兩種基因型，ACE基因I/D的II、ID、DD 3種基因型，AGT基因M235T的MM、MT、TT 3種基因型基因測序結(jié)果采用局域序列對位排列計(jì)算工具(BLAST)進(jìn)行比對后證實(shí)一致，見圖2。

2.5亞組分析腎功能損害組與無腎功能損害組ACE基因I/D基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組AT1R基因A1166C和AGT基因M235T基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

注：A為AT1R基因A1166C電泳圖；B為ACE基因I/D電泳圖；C為AGT基因M235T電泳圖

圖1RAS基因多態(tài)性電泳圖

Figure1Electrophoretic map of RAS genetic polymorphism

注：A為AT1R基因A1166C AA型，B為AT1R基因A1166C CC型；C為ACE基因I/D DD型，D為ACE基因I/D ID型，E為ACE基因I/D II型；F為AGT基因M235T MM型，G為AGT基因M235T MT型，H為AGT基因M235T TT型

圖2RAS基因多態(tài)性基因測序圖

Figure2Gene sequencing diagram of RAS genetic polymorphism

表1　兩組AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型和等位基因分布比較〔n(%)〕

表2　AT1R基因A1166C、ACE基因I/D、AGT基因M235T基因型和等位基因分布的亞組分析

3　討論

IgA腎病是一種腎小球系膜區(qū)IgA沉積或以IgA沉積為主的原發(fā)性腎小球疾病，主要病變特點(diǎn)為彌漫性腎小球系膜細(xì)胞、基質(zhì)增生，IgA呈顆粒狀或團(tuán)塊狀在系膜區(qū)或毛細(xì)血管壁分布，病變程度輕重不一，如出現(xiàn)腎功能損害，則病情緩慢進(jìn)展，預(yù)后不良。近年來，遺傳因素在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中的作用引起了學(xué)者們的重視[2-4]。在眾多原發(fā)性腎小球疾病的候選基因和位點(diǎn)中，RAS的編碼基因是目前研究最多的易感基因。

ACE的主要生理功能是將血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)轉(zhuǎn)化為效應(yīng)肽血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)，在腎臟系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、電解質(zhì)和容量平衡的維持中起重要作用。ACE基因位于染色體17q23，編碼區(qū)全長21 kb，包含25個(gè)內(nèi)含子和26個(gè)外顯子。其中第16內(nèi)含子中存在I/D多態(tài)性。近年來，ACE基因I/D多態(tài)性與疾病的相關(guān)性已引起學(xué)者們的關(guān)注[5-6]。一項(xiàng)關(guān)于ACE基因I/D多態(tài)性與IgA腎病相關(guān)性的Meta分析顯示，DD基因型和D等位基因與亞洲人和總體人群IgA腎病發(fā)病的關(guān)系密切，在亞洲人群中DD基因和D等位基因是IgA腎病發(fā)病的致病基因，II基因是保護(hù)性基因[7]。本研究結(jié)果顯示，IgA腎病患者ACE基因I/D多態(tài)性與健康人之間存在明顯差異，與既往研究結(jié)果一致。有部分研究推測RAS基因多態(tài)性與IgA腎病腎功能損害有關(guān)。Huang等[8]在研究IgA腎病所致的終末期腎臟病患者RAS基因多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T基因型在IgA腎病組與正常對照組的分布相似，而IgA腎病致終末期腎臟病組與IgA腎病不伴終末期腎臟病組比較，僅ACE基因DD基因型分布明顯升高，說明攜帶DD基因型的IgA腎病患者更易于發(fā)生終末期腎臟病。Hsu等[9]發(fā)現(xiàn)，IgA腎病腎功能惡化患者DD基因型的分布明顯升高，其認(rèn)為ACE基因I/D多態(tài)性與IgA腎病腎功能損害有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IgA腎病腎功能損害患者ACE基因I/D的DD基因型和D等位基因分布較無腎功能損害患者明顯升高，與既往研究結(jié)果一致[10]，證明ACE基因I/D多態(tài)性與IgA腎病腎功能損害有關(guān)。

ATlR主要分布于血管、心臟、腎臟、腦和肝臟，是介導(dǎo)維持和升高血壓的關(guān)鍵因子AngⅡ的受體，可通過血管收縮促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，在維持血壓及靶器官損害過程中起著重要作用。AT1R基因位于3號(hào)染色體，可編碼356個(gè)氨基酸，編碼區(qū)全長1 kb，僅有1個(gè)外顯子。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)AT1R基因有5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，即T573→C，A1062→G，A1166→C，G1517→T，A1878→G[11]，其中A1166C多態(tài)性與腎小球疾病有關(guān)，因此，AT1R基因A1166C多態(tài)性在腎小球疾病中的遺傳標(biāo)記為腎病學(xué)者所關(guān)注。Woo等[12]在研究IgA腎病患者AT1R基因A1166C多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，AT1R基因A1166C多態(tài)性與IgA腎病無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IgA腎病患者AT1R基因A1166C多態(tài)性與健康人之間無明顯差異，且AT1R基因A1166C多態(tài)性在腎功能損害與無腎功能損害患者中的分布也無明顯差異。

AGT是一種在肝臟合成的球狀糖蛋白，其作為腎素底物在調(diào)節(jié)血壓方面發(fā)揮著重要作用。AGT基因位于染色體1q42～43，全長12 kb，包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，其第2外顯子704上的堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致AGT第235位的蛋氨酸被蘇氨酸替換。黃海東等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AGT基因M235T多態(tài)性與IgA腎病的發(fā)病、臨床特征、病理特征等均無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IgA腎病患者AGT基因M235T多態(tài)性與健康人之間無明顯差異，且AGT基因M235T多態(tài)性在腎功能損害與無腎功能損害患者中的分布也無明顯差異。

綜上所述，ACE基因I/D多態(tài)性與IgA腎病的發(fā)生、出現(xiàn)腎功能損害有關(guān)，DD基因和D等位基因是IgA腎病患者發(fā)生腎功能損害的易感因素；IgA腎病患者RAS基因多態(tài)性除與種族、臨床特征、病理特征等有關(guān)外，還可能與RAS基因在IgA腎病中的作用機(jī)制、遺傳學(xué)背景等有關(guān)。但由于本研究樣本量較小，對于IgA腎病高危人群的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測還有待于在更大樣本、多中心的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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