C反應蛋白基因多態性及環境因素交互作用與中國人群缺血性腦卒中的關聯研究

李繼來，陳忠云，李曉峰，李 婧，杜繼臣，楊 旭

缺血性腦卒中(IS)是由遺傳和環境等多種因素共同作用導致的一種多因素疾病[1]。傳統的危險因素如年齡、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙等很難完全解釋疾病的發生、發展過程。研究表明，動脈粥樣硬化(AS)作為一種導致IS的主要病因，被認為是一種炎性疾病[2-3]。C反應蛋白(CRP)作為一種參與全身炎癥反應的炎性標志物[4]，參與了AS的發生、發展，能夠反映AS斑塊中的炎癥活動水平[5-7]，對IS的發病、嚴重程度及預后等有重要的預測價值[8-12]，可以作為預測老年人IS發病的標記物。已有研究表明，CRP基因一些單核苷酸多態性(SNP)位點與IS密切相關[13-14]，但亦有爭議[15-16]。基于此，本研究擬采用基于中國漢族人群的病例對照研究，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術，觀察漢族IS患者和健康人群的基因多態性分布，探討CRP基因兩個SNP(rs1800947和rs3093059)位點與IS及其亞型的相關性,并進一步研究CRP基因多態性與環境因素的交互作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年10月—2011年12月連續收集入住航天中心醫院神經內科的IS患者159例為病例組，其中男112例，女47例；平均年齡(65.4±8.2)歲。所有患者為發病5 d內入選，IS診斷符合世界衛生組織(WHO)卒中診斷標準。排除以下疾病：腦腫瘤、腦血管畸形、代謝性疾病(糖尿病除外)、感染、自身免疫性疾病、血液系統疾病、腫瘤和嚴重的慢性疾病(如肝、腎功能不全等)。同期從體檢中心隨機選取年齡、性別與病例組相匹配的健康者175例為對照組,其中男106例，女69例；平均年齡(65.8±8.6)歲。根據臨床分析和實驗室評估，按照病例組的篩選標準，同樣排除上述的腦腫瘤等疾病。所有受試者互不相關且均來自北京。本研究經當地倫理協會和醫院倫理委員會審查批準。所有患者簽署知情同意書。

1.2 資料收集 由同一位醫生對每例患者及對照者采用統一的調查問卷和詢問方式，包括現病史和既往史、體格檢查、實驗室檢查以及個人史〔體質指數(BMI)、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史〕等。對所有患者行顱腦磁共振成像(MRI)和(或)顱腦CT、心臟超聲、頸外動脈雙重成像以及實驗室檢查，必要時行磁共振血管造影(MRA)以及多普勒超聲心動圖(PDE)。根據TOAST(the Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment)分型，排除其他病因引發的IS以及原因不明的IS，把病例組分為大動脈粥樣硬化(LAA)組、小動脈阻塞(SAA)組、心源性栓塞(CE)組。

1.3 定義 BMI=體質量(kg)/身高2(m2)，BMI≥25 kg/m2為肥胖和(或)超重。高血壓指收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mm Hg，或者接受高血壓藥物治療。糖尿病指有糖尿病的相關臨床癥狀，并且1 d當中任意時候血糖水平≥11.1 mmol/L，或空腹至少8 h后，血糖水平≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)2 h血糖水平≥11.1 mmol/L。冠心病指既往有明確的心絞痛史、心肌梗死史。吸煙史指5年內至少每天吸煙10支。飲酒史指平均每天飲白酒2兩以上，連續5年以上。腦卒中家族史指至少一個一級直系親屬曾患腦梗死。

1.4 基因多態性分析

1.4.1 DNA提取 IS患者入院次日及對照組受檢者體檢當日清晨采集空腹肘靜脈血2 ml(EDTA抗凝)，用鹽析法[17]提取外周血白細胞中基因組DNA，-80 ℃冰箱凍存備用。

1.4.2 標簽SNP選擇 以NCBI SNP數據庫中中國漢族人群的數據為基礎，選擇最小等位基因頻率(MAF)>18%的SNP或者已被報道的SNP為研究目標位點，最終選擇了位于第二外顯子區的rs1800947和啟動子區的rs3093059。

1.4.3 引物設計及基因型的測定 應用Premier 5.0軟件自行設計CRP rs1800947和rs3093059引物，并經GENEBANK中BLAST分析其特異性高，由上海英俊生物技術有限公司合成。(1)PCR反應體系：20 μl反應體系包括上下游引物各4 pmol，基因組DNA(鹽析法提取) 10 ng，2×PCR Mix〔天根生化科技(北京)有限公司，貨號：KT201〕10 μl，加水補足反應體系。(2)PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環，最后72 ℃延伸7 min。反應結束后，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統觀察PCR擴增結果。(3)酶切與電泳：取PCR擴增產物10 μl，加入限制性內切酶10 U和2 μl內切酶緩沖液混合，溫育過夜。以2%瓊脂糖凝膠對PCR酶切產物進行電泳檢測，溴化乙錠0.5 mg/L染色，電泳緩沖液為0.5倍Tris-硼酸緩沖液(0.5×TBE)，選擇電泳電壓100 V(5 V/cm)，在紫外分析儀上觀察結果并照相，根據電泳后見到的條帶分析基因型(見表1)。

1.4.4 基因分析 rs1800947經PCR擴增后產生663 bp片段，rs1800947 CC基因型者無Tsp45I酶切位點，酶切圖譜只見663 bp 1條帶；GG基因型者兩等位基因序列都發生G>C突變，出現Tsp45I酶切位點，酶切圖譜可見530 bp、104 bp 2條帶；GC雜合基因型者可見663 bp、530 bp、104 bp 3條帶，測序結果證實此位點發生G>C置換。rs3093059基因的PCR擴增產物片段長度為285 bp，擴增片段內另有一個酶切位點。TT基因型(野生型)的擴增產物可被完全切斷，主要可見178 bp、64 bp、53 bp 3種片段；TC基因型為雜合子，可見242 bp、178 bp、64 bp、53 bp 4種片段；CC基因型(突變純合子)不能被酶切斷，可見242 bp和53 bp 2種片段。測序結果證實此位點發生T>C置換。

2 結果

2.1 病例組與對照組臨床資料比較 病例組較對照組冠心病史、高血壓史、糖尿病史、BMI≥25 kg/m2、吸煙史、飲酒史的檢出率增高，差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組年齡、性別、三酰甘油、總膽固醇水平及腦卒中家族史比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表1 CRP基因引物序列、內切酶和酶切片段長度

表2 對照組與病例組臨床資料比較

注：BMI=體質指數

2.2 病例組與對照組基因型和等位基因比較 rs1800947和rs3093059的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。一般人群中以上基因位點各等位基因已經達到遺傳平衡，具有較好的人群代表性。

Logistic回歸校正相關混雜因素(性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史)后，病例組與對照組rs1800947 GG和GC基因型分布比較，差異有統計學意義〔OR=3.456，95%CI(1.350，8.845)，P=0.010〕。病例組與對照組rs1800947 G和C等位基因分布比較，差異有統計學意義〔OR=3.069，95%CI(1.237，7.612)，P=0.016〕。rs3093059基因型和等位基因分布與IS無相關性(見表3)。

Logistic回歸校正相關混雜因素后，rs1800947 GC基因型與SAA的發生有統計學關聯〔OR=6.225，95%CI(1.739，22.291)，P=0.005〕；rs3093059基因型與IS亞型無相關性(見表4)。

2.3 rs1800947與環境因素的交互作用 與rs1800947 GG基因型且無吸煙史、飲酒史的個體相比，rs1800947 GC基因型且有吸煙史以及飲酒史的個體患IS的風險上升，校正相關危險因素后，OR值分別為6.667和11.110(見表5)。

表3 對照組與病例組rs1800947和rs3093059基因型和等位基因比較(例)

注：*多元Logistic回歸校正性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史

表4 病例組不同亞型與對照組rs1800947和rs3093059基因型和等位基因比較(例)

注：LAA=大動脈粥樣硬化，SAA=小動脈阻塞，CE=心源性栓塞;*多元Logistic回歸校正性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史

表5 rs1800947與環境因素的交互作用分析(例)

注：*多元Logistic回歸校正性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史以及腦卒中家族史

3 討論

炎癥機制參與了動脈粥樣硬化疾病諸如心腦血管疾病的發生發展[18-20]，CRP作為炎性標志物其血清水平能夠有效預測心血管事件的發生。研究表明，血清CRP水平升高是IS的獨立危險因素[18-20]。在影響血清CRP水平的因素中，遺傳因素發揮了39%～52%的作用[21-23]，因此進一步對CRP基因SNP的研究有著重要的意義。

本研究結果顯示，rs1800947 G、C等位基因分布有差異，表明攜帶rs1800947等位基因C的個體患IS的可能性更大。經多元Logistic回歸校正相關危險因素后，與GG基因型相比，rs1800947 GC基因型增加了IS的發病風險。日本Morita等[24]對152例IS患者和304例老年正常人群進行研究，使用TaqMan探針對CRP基因rs1800947進行基因分型，校正相關危險因素后發現，相對rs1800947的GG基因型而言，GC是IS的獨立危險因素〔95%CI(1.3，10.9)，P=0.016〕，本研究結果與其報道一致。但Ladenvall等[14]在2006年對瑞典600例IS患者和600例正常對照者進行的病例對照研究，運用TaqMan探針對CRP基因進行基因分型，結果卻未發現IS與rs1800947基因型具有相關性〔OR=1.14，95%CI(0.81，1.61)〕。國內Liu等[16]在2008年應用PCR-RFLP檢測222例IS/TIA患者(122例單純顱內動脈粥樣硬化病變者和100例單純顱外動脈粥樣硬化病變者)及227例對照組的CRP基因rs1800947進行基因分型，結果提示IS/TIA組與對照組的rs1800947基因型及等位基因頻率均無差異。可以看出，rs1800947 SNP與IS風險的相關性研究尚有爭議。

本研究中未發現rs3093059基因型與IS發病風險間有關聯。一項來自美國國家心肺血液研究院(NHLBI)以家庭為基礎的大型橫斷面研究利用焦磷酸測序技術對1 296例高加索人CRP基因rs3093059進行基因型分析，結果亦未發現rs3093059與心血管疾病之間存在關聯[15]。國內Shen等[25]對584例中國IS患者與993例相匹配的對照者進行的一項病例對照研究，結果表明rs3093059與IS間存在相關性，rs3093059的加性模型、顯性模型以及等位基因頻率分布的OR值及95%CI分別為0.697(0.528，0.921)、0.671(0.487，0.923)、0.811(0.666，0.988)。這些有爭議的結果可能是由于種族、樣本量以及研究設計方法的不同所致。

本研究結果顯示，CRP基因中的rs1800947 GC基因型與SAA有關，而與LAA及CE無關，這與德國的Kuhlenbaeumer等[26]研究相一致。SAA主要由腔隙性腦梗死和腦白質疏松等構成。腔隙性腦梗死被認為是由小穿支動脈的脂質透明樣變性和微細血管硬化，由于原位血栓形成所造成；而腦白質疏松的發病機制有待闡明。SAA的發病機制主要為血液運輸管道的結構改變、血管舒縮調節障礙[27]、血-腦脊液屏障功能破壞[28]以及細胞間液重吸收障礙[29]。有研究表明，在SAA中發現炎性內皮細胞的激活以及內皮功能的紊亂。發生機制可能是CRP作為一種急性炎性時相反應指標，可誘導內皮細胞黏附分子的產生[30-31]，通過受體介導的趨化反應募集單核細胞[32-33]，誘導單核細胞產生組織因子[34]，進而促進內皮細胞損傷，引起SAA。然而，先前的一些研究并未顯示CRP基因的遺傳變異與SAA有關[35-36]。

本研究進一步評價這兩個SNP位點及環境因素的交互作用與IS的相關性。結果發現，吸煙狀態與rs1800947 GC基因型，飲酒狀態與rs1800947 GC基因型之間存在交互作用。與rs1800947 GG基因型且無吸煙史、飲酒史的個體相比，rs1800947 GC基因型且有吸煙史、飲酒史的個體患IS的風險上升，提示GC基因型與吸煙、飲酒的交互作用在IS的發生效應上有放大作用。國外學者Humphries等[37]提出，吸煙可能通過內皮細胞分泌細胞核的轉錄因子并刺激肝細胞合成CRP，CRP可作用于內皮細胞，誘導黏附分子的表達，引起血液中的一些炎性細胞移行至內皮下，并釋放一些炎性遞質從而進一步損傷內皮功能[38]。飲酒與炎性反應的并存可能通過改變血液凝固和纖維蛋白溶解等機制而增加IS的易患性。

綜上所述，CRP基因rs1800947 GC基因型參與了IS及其SAA的發生，并發現其與吸煙、飲酒間存在交互作用。CRP基因rs1800947位點的多態性為IS的危險因素提供了新的證據。本研究為病例對照研究，樣本量較小，需要謹慎分析結果，可進一步行大樣本及高質量前瞻性研究論證。

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