RNA干擾CLEC2B基因沉默對淋巴細胞可溶性白介素2受體mRNA表達的影響

張峻嶺,柳君如，徐士福,程 琳，馬秀亮

白癜風為一種自身免疫相關性皮膚病已成共識，研究發現白癜風患者皮損內殺傷性T淋巴細胞浸潤可以直接破壞黑素細胞，近年發現，免疫系統失調與基因的差異表達密切相關。國外學者Yu等[1]應用基因芯片技術發現白癜風皮損區CLEC2B mRNA表達高于非皮損區。筆者應用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法，發現白癜風患者皮損區CLEC2B基因較正常人表達增加,并發現CLEC2B基因過表達的淋巴細胞培養上清液對黑素細胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用[2],同時發現CLEC2B基因過表達可上調與白癜風密切相關的細胞因子可溶性白介素2受體(sIL-2R)mRNA的表達。為進一步闡明CLEC2B基因在白癜風發病中的作用，在此基礎上本研究利用RNA干擾技術，使 CLEC2B基因沉默，觀察CLEC2B基因沉默后淋巴細胞sIL-2R mRNA的變化，旨在探索該基因功能相關細胞因子及其參與的信號傳導途徑，從而推測該基因參與白癜風發病的免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 DMRIE-C脂質體及OPTI MEM購于美國Invitrogen公司，CLEC2B引物序列由不列顛哥倫比亞大學Youwen zhou教授惠贈，CLEC2B siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，RPMI 1640液態培養基購于美國Gibco公司,DMEM高糖液態培養基、TBD胎牛血清購于天津灝洋生物科技有限公司，TRIzol、TRANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix(SYBR Green I)均購于天根生化科技(北京)有限公司，MTT細胞增殖及細胞毒性檢驗試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，DMSO購于美國Sigma公司，人Jurkat淋巴瘤細胞株來自中國科學院血液病研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養條件均為37 ℃，5%二氧化碳(CO2)進行培養，Jurkat淋巴瘤細胞用RPMI 1640培養基，以密度為2×105/ml接種于25 cm2培養瓶，待細胞處于對數生長期、密度近1×106/ml(融合度近80%)時進行實驗。

1.2.2 siRNA轉染 DMRIE-C脂質體轉染3條CLEC2B siRNA入Jurkat淋巴瘤細胞，采用反向轉染法[3]，轉染體系為600 μl，siRNA終濃度約80 nM，siRNA∶DMRIE-C實際配比=3 μl∶2 μl。實驗共設定CLEC2B沉默組(沉默1組、沉默2組、沉默3組)、非沉默對照組(轉染scrambled siRNA，該siRNA無基因干擾效應，是與目的基因序列無同源性的陰性對照siRNA序列)及空白對照組(不做任何處理)，轉染具體步驟按試劑盒說明操作。

1.2.3 CLEC2B基因沉默效率檢測 轉染后48 h，收集細胞，進行RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量RT-PCR方法檢測CLEC2B基因沉默效率。具體步驟按照試劑盒說明操作。CLEC2B上游引物5′-CCCCTATGATTGGATTGGTT-3′，下游引物5′-GGCATGTTGAGTGGAACAGT-3，產物大小79 bp；β-actin上游引物 5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT-3′，下游引物 5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′，產物大小124 bp。應用RG-3000熒光定量PCR儀(澳大利亞Corbett Research Sydney 公司)進行檢測以選取沉默效率最高的CLEC2B siRNA進行后續實驗。

1.2.4 CLEC2B基因沉默后淋巴細胞增殖率檢測 實驗分組：空白對照組(未進行轉染)、非沉默對照組(轉染scrambled siRNA)、CLEC2B沉默組(轉染最佳CLEC2B siRNA)，每組設3個復孔。選擇基因沉默效率最高的CLEC2B siRNA進行轉染，轉染后培養48 h，MTT法測細胞增殖率，具體步驟按說明書進行。酶標儀在570 nm波長處測各孔的光密度(A值)。

1.2.5 sIL-2R mRNA表達水平 選擇轉染后48 h CLEC2B基因沉默率最高的轉染組，進行RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量PCR方法檢測sIL-2R mRNA表達情況，具體步驟按照試劑盒說明操作。實驗分為3組：空白對照組(未進行轉染)、非沉默對照組(轉染scrambled siRNA)、CLEC2B沉默組(轉染最佳CLEC2B siRNA)，每組設3個復孔。sIL-2R引物經Pubmed檢索基因序列后，由南京金瑞斯生物科技有限公司設計合成。sIL-2R上游引物5′-GAATTTATCATTTCGTGGTGGTCTCCG-3′，下游引物5′-TCTTCTACTCTTCCTCTGTCTCCG-3′，產物大小298 bp，三步法PCR反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性5 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。

1.2.6 結果分析 基因表達相對變化采用2-△△Ct法處理數據[4]。統計分析時用△Ct代表基因的相對定量，Ct值代表目標基因擴增產物達到設定閾值所經歷的循環數?！鰿t=目的基因Ct值-內參基因Ct值，△△Ct=待測樣本△Ct-標準樣本△Ct。

2 結果

2.1 CLEC2B基因沉默效率檢測 轉染CLEC2B siRNA后，各CLEC2B沉默組較非沉默對照組CLEC2B mRNA表達下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。各CLEC2B沉默組siRNA序列對CLEC2B基因沉默效率不等，差異有統計學意義(P<0.01)；其中沉默2組siRNA沉默效率最高，與沉默1組和沉默3組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 CLEC2B基因沉默后對淋巴細胞增殖率及其sIL-2R mRNA表達的影響 CLEC2B基因沉默后，空白對照組、非沉默對照組、CLEC2B沉默組淋巴細胞增殖率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。3組sIL-2R mRNA相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中CLEC2B沉默組較非沉默對照組降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table1 Comparison of CLEC2B mRNA expression quantity and slicensing effect among each group

組別CLEC2BmRNA(2-△△Ct)沉默效率(%)空白對照組1.00-非沉默對照組0.94±0.02 -沉默1組0.73±0.02*23.0±3.3△沉默2組0.61±0.03*35.0±1.9 沉默3組0.80±0.01*14.8±2.5△F值204.4089.30P值<0.01<0.01

注：與非沉默對照組比較，*P<0.05；與沉默2組比較，△P<0.05

Table2 Comparison of lymphocytes proliferation rate and sIL-2R mRNA expression among each group

組別A值sIL-2RmRNA(2-△△Ct)空白對照組0.39±0.041.00非沉默對照組0.35±0.030.87±0.04 CLEC2B沉默組0.36±0.040.34±0.03*F值1.95435.80P值>0.05<0.01

注：與非沉默對照組比較，*P<0.05

3 討論

CLEC2B基因編碼位于12號染色體12p13-p12自然殺傷(NK)細胞基因復合體區，與NKG2D、 LOX-1和Dectin-1等構成復合體，屬于C型凝集素超家族成員，有研究顯示CLEC2B基因表達于各種血細胞[5]，并可在活化的淋巴細胞中轉錄表達增加，為淋巴細胞活化后早期轉錄表達的基因[6]。本實驗發現RNA干擾淋巴細胞中CLEC2B基因沉默后，細胞因子sIL-2R mRNA表達下調，反之可推測，白癜風患者體內CLEC2B的過表達可能引起sIL-2R水平升高，這對激活NK細胞殺傷活性、活化T淋巴細胞有重要意義。與此同時，國內外多項實驗均證實IL-2、sIL-2R在白癜風患者血清中表達升高，且與白癜風嚴重程度相關[7]，通過本實驗結果進一步推測sIL-2R與CLEC2B參與的信號傳導途徑有一定相關性，參與白癜風的發病機制可能是：IL-2可誘導NK細胞增殖分化，亦可刺激NK細胞產生γ干擾素(INF-γ)，反之INF-γ既能活化NK細胞，又能誘導NK細胞表達IL-2受體，從而增強細胞對IL-2的反應性。這樣，就形成一個NK細胞-IL-2-INF-γ系統，既可以對NK細胞的數量和功能進行自我調節，又可以調節T、B淋巴細胞及其他免疫細胞的數量和功能[8-9]。已有研究表明，NK細胞與T淋巴細胞之間存在密切的免疫相關性，多種細胞因子參與彼此之間的調節，其共同終末效應為作用于黑素細胞，影響其存活及黑素合成功能。

本實驗通過RNA干擾沉默CLEC2B基因，實驗數據表明這直接影響了淋巴細胞sIL-2R的表達，結合本課題組既往已驗證白癜風患者皮損內CLEC2B基因表達增多的現象，可推斷CLEC2B基因參與白癜風發病機制可能通過影響sIL-2R等細胞因子轉錄表達，直接刺激T淋巴細胞活化分化和間接影響NK細胞的功能，最終引發黑素細胞減少白癜風的發生，證實了CLEC2B是參與白癜風發病的信號傳導途徑之一，而抑制該基因轉錄表達可阻止白癜風的病情進展，這為白癜風基因學及免疫學研究及白癜風的基因治療提供了新的研究方向。目前，國內外對CLEC2B基因的研究多集中于抗腫瘤及抗感染等領域，而近期，CLEC2B參與的NK細胞相關免疫機制已受到國內外研究關注[10]，關于該基因的功能及其他相關免疫學機制還有待繼續深入研究。

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