ARHI蛋白在喉鱗癌組織中的表達及其臨床意義

張再興

喉癌是我國北方地區最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，近幾年其發病率呈上升趨勢，但目前其發病機制還不十分清楚。ARHI基因是母源性印跡腫瘤抑制基因[1]，該基因定位于1p31，分子量為26 000，結構上與Ras家族具有高度同源性，屬于小分子G蛋白的一種。研究表明，盡管ARHI基因屬于Ras超家族成員之一，但其與大部分Ras家族成員都是癌基因不同，ARHI基因具有抑癌作用[2-3]。目前，關于ARHI基因與喉鱗癌的關系研究鮮見報道，本研究旨在探討ARHI蛋白在喉鱗癌組織中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇1996年11月—2012年10月在我院接受手術治療并經兩位以上病理專家確診的喉鱗癌患者60例，其中男38例，女22例；年齡28～76歲，平均61.2歲；排除術前接受放療及化療的患者。

1.2 方法 手術切除癌組織后10 min內取材，取材時避免取到明顯的壞死區域，同時選取其中30例患者的癌旁組織作為對照，癌旁組織為距癌組織至少0.5 cm處遠端正常喉組織。采用免疫組化法(SP法)檢測ARHI蛋白的表達，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

將切取的組織標本常規石蠟包埋、切片后于60 ℃烤箱干烤4 h，常規脫蠟至水，3%過氧化氫溶液浸泡10 min滅活內源性過氧化物酶，然后加入10 mmol/L濃度pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液于100 ℃煮沸10 min，進行抗原修復；室溫自然冷卻30 min后加入正常馬血清，室溫下封閉20 min，加入一抗小鼠抗人ARHI單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)，按1∶100稀釋，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后加入生物素化二抗，室溫30 min，PBS洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫下封閉30 min，PBS洗滌3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封固后于光鏡下進行觀察。

1.3 結果判定 結果判定由兩位經驗豐富且不知曉本研究內容的病理科醫生完成，用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定方法參照文獻[3-4]：每張切片隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞；根據陽性區域染色強度評分(0分：無著色；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色)及陽性細胞所占比例評分(0分：1%；1分：1%～10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)進行半定量評分，計算兩項評分的乘積，分值范圍為0～12分，以乘積>3分為ARHI蛋白陽性表達。

1.4 統計學方法 使用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARHI蛋白的表達 光鏡觀察結果顯示，癌旁組織中胞質及部分胞核可見大量棕黃色顆粒(見圖1)，喉鱗癌組織中胞質及胞核中可見少量棕黃色顆粒(見圖2)。癌旁組織ARHI蛋白陽性表達率為83.33%(25/30)，喉鱗癌組織ARHI蛋白陽性表達率為48.33%(29/60)，喉鱗癌組織ARHI蛋白陽性表達率低于癌旁組織 (χ2=10.21，P<0.01)。

圖1 癌旁組織中ARHI蛋白的表達(SP法,×400)

2.2 ARHI蛋白表達與患者臨床特征間的關系 不同性別、年齡、原發部位喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期者(P<0.05)，有淋巴結轉移的喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，病理分級高中分化喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達率高于低分化者(P<0.05，見表1)。

圖2 喉鱗癌組織中ARHI蛋白的表達(SP法,×400)

Figure2 Expression of ARHI protein in laryngeal squamous cell carcinoma tissues

表1 ARHI蛋白表達與患者臨床特征間的關系

Table1 Relationship between expression of ARHI protein and patients′clinical features

臨床特征例數ARHI蛋白陽性表達率〔n(%)〕χ2值P值性別0.29>0.05 男3818(47.37) 女2212(54.55)年齡(歲)1.07>0.05 ≥602816(57.14) <603214(43.75)原發部位0.23>0.05 聲門上區2214(63.64) 聲門區3520(57.14)臨床分期5.05<0.05 Ⅰ～Ⅱ2115(71.43) Ⅲ～Ⅳ3916(41.03)淋巴結轉移5.45<0.05 無4842(87.50) 有1216(41.03)病理分級5.39<0.05 高中分化3731(81.08) 低分化2313(56.52)

注：有3例患者原發部位為聲門下區病變，未納入統計分析

3 討論

喉癌中90%以上為鱗狀細胞癌，而在喉鱗癌確診時約有40%的患者已為晚期，患者5年生存率在50%以下[5]，因此，喉鱗癌的早期診斷非常重要。隨著分子生物學的快速發展和癌變研究的逐漸深入，一些與腫瘤發生、發展相關的癌基因和抑癌基因相繼被發現[6]。ARHI基因編碼的蛋白在人類多種組織中表達，其中以正常乳腺、卵巢組織中的表達最高，而在大多數乳腺癌、卵巢癌組織中，其表達明顯缺失或降低[4，7-8]。有研究發現，ARHI蛋白在胃癌組織中表達明顯下調或缺失,而在胃正常組織中普遍表達，且ARHI蛋白表達與腫瘤分化程度及TNM分期有關[9]。因此，ARHI蛋白可能在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用。

本研究結果顯示，喉鱗癌組織中ARHI蛋白陽性表達率明顯低于癌旁組織，與其他學者在肝癌、前列腺癌等癌組織的檢測結果基本一致[10-13]，提示ARHI蛋白表達在喉鱗癌的發生發展過程中起著重要作用。通過分析ARHI蛋白與患者臨床特征間的關系發現，ARHI的低表達與患者臨床分期、淋巴結轉移及病理分級有關，提示ARHI蛋白可能與腫瘤組織上皮分化、病變進展及侵襲性有關。體外實驗證明，ARHI蛋白可誘導胰腺癌細胞凋亡，死亡相關蛋白激酶1(DAPK-1)參與了ARHI蛋白引起的凋亡[3]。此外，也有研究發現ARHI基因可通過誘導G1期細胞而抑制癌細胞生長[1,3]。由于ARHI基因突變或失活，導致ARHI蛋白低水平表達或表達缺失，從而失去了其對細胞生長、增殖的負性調控作用，促進了腫瘤的發生和發展。

綜上所述，ARHI蛋白的低表達可能是喉鱗癌發生、發展過程中的一個重要事件，檢測ARHI蛋白的表達在喉鱗癌的診斷、治療和預后評估中可能具有重要的臨床應用價值，其可能成為喉鱗癌分子標志物或治療的潛在靶點；而有關ARHI蛋白在喉鱗癌組織中表達的具體機制還有待應用分子生物學方法進一步研究。

1 Li Y,Shi L,Han C,et al.Effects of ARHI on cell cycle progression and apoptosis levels of breast cancer cells[J].Tumour Biol,2012,33(5):1403-1410.

2 李琴華,岳瑛,朱繼紅,等.信號轉導及轉錄激活因子3在腫瘤發生發展中的作用[J].中國全科醫學,2010,13(26):3004-3007.

3 Lu X,Qian J,Yu Y,et al.Expression of the tumor suppressor ARHI inhibits the growth of pancreatic cancer cells by inducing G1 cell cycle arrest[J].Oncol Rep,2009,22(3):635-640.

4 Janssen EA,Ovestad IT,Skaland I，et al.LOH at 1p31(ARHI)and proliferation in lymph node-negative breast cancer[J].Cell Oncol,2009,31(5):335-343.

5 Dequanter D,Lothaire P,Zouaoui K,et al.Epidemiology and clinical characteristics of larynx and hypopharynx carcinoma:a comparative study in the Hainaut and review of the literature[J].Acta Chir Belg,2012,112(6):423-425.

6 Dionysopoulos D,Pavlakis K,Kotoula V,et al.Cyclin D1,EGFR,and Akt/mTOR pathway.Potential prognostic markers in localized laryngeal squamous cell carcinoma[J].Strahlenther Onkol,2013,189(3):202-214.

7 Chen MY,Liao WS,Lu Z,et al.Decitabine and suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA)inhibit growth of ovarian cancer cell lines and xenografts while inducing expression of imprinted tumor suppressor genes,apoptosis,G2/M arrest,and autophagy[J].Cancer,2011,117(19):4424-4438.

8 Badgwell DB,Lu Z,Le K,et al.The tumor-suppressor gene ARHI(DIRAS3)suppresses ovarian cancer cell migration through inhibition of the Stat3 and FAK/Rho signaling pathways[J].Oncogene,2012,31(1):68-79.

9 Wang W,Bu XM,Wang J,et al.The expression of ARHI in pT2a and pT2b stage gastric cancer and its clinical significance[J].Oncol Rep,2012,27(6):1953-1959.

10 Zhao X,Li J,Zhuo J,et al.Reexpression of ARHI inhibits tumor growth and angiogenesis and impairs the mTOR/VEGF pathway in hepatocellular carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,403(3/4):417-421.

11 Huang J,Lin Y,Li L,et al.ARHI,as a novel suppressor of cell growth and downregulated in human hepatocellular carcinoma,could contribute to hepatocarcinogenesis[J].Mol Carcinog,2009,48(2):130-140.

12 Chen Y,Zaman MS,Deng G,et al.MicroRNAs 221/222 and genistein-mediated regulation of ARHI tumor suppressor gene in prostate cancer[J].Cancer Prev Res(Phila),2011,4(1):76-86.

13 Lin D,Cui F,Bu Q,et al.The expression and clinical significance of GTP-binding RAS-like 3(ARHI) and microRNA 221 and 222 in prostate cancer[J].J Int Med Res,2011,39(5):1870-1875.