枸杞多糖對糖尿病大鼠血糖水平及機體免疫功能的影響

李曉冰，陳玉龍，展俊平，謝忠禮，朱艷琴，沈小君，李瑞琴

大量臨床及藥理實驗證明，枸杞多糖具有降低血糖水平的功效[1-4]。糖尿病患者在持續高血糖水平狀態下易出現大血管及微血管并發癥，誘發各種感染及酮癥酸中毒，這些并發癥的出現與糖尿病患者免疫功能低下密切相關[5]。然而，目前關于枸杞多糖的報道多集中于改善糖尿病癥狀，對于具體機制研究較少。本研究從免疫學角度探討枸杞多糖治療糖尿病的機制，以期為枸杞多糖的臨床應用及功能性食品的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 Wister大鼠70只，全部雄性，體質量(200±20)g，由河北省實驗動物中心提供。動物許可證編號為SCXK(冀)2008-1-003。

1.2 主要藥物及試劑 枸杞多糖(批號：H22023655，寧夏啟元藥業有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT，美國Amresco公司)，鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)；鼠淋巴細胞分離液(深圳達科為生物技術有限公司)，抗大鼠FITC-CD3、PE-CD4、PE-CY5-CD8抗體(美國eBioscience公司)；葡萄糖試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動物造模及分組 70只大鼠適應性喂養3 d，隨機選取12只為正常對照組，其余大鼠尾靜脈注射STZ制備1型糖尿病大鼠模型[6]，作為造模組。第7天尾部取血測血糖水平，選取血糖水平>11.1 mmol/L的大鼠48只，納入實驗[7]。將48只大鼠隨機分為4組，模型組12只、多糖高劑量組12只、多糖中劑量組12只、多糖低劑量組12只。多糖低、中、高劑量組按照預實驗分別按100、200、400 mg/kg枸杞多糖灌胃給藥，正常對照組和模型組使用同體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。1次/d，持續4周。各組末次給藥24 h后腹主動脈取血，無菌取脾臟、胸腺。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 血糖水平測定 按試劑盒說明書測定不同時間段(造模第2、4周)血糖水平。

1.4.2 脾臟、胸腺指數測定 乙醚麻醉取血后，處死大鼠。剝離脾臟、胸腺，稱重。脾臟指數=脾臟質量/體質量，胸腺指數=胸腺質量/體質量。

1.4.3 脾淋巴細胞轉化實驗 取各組大鼠6只，無菌取出脾臟放入盛有少量磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的培養皿中，用5 ml注射器針芯研磨脾臟，移入離心管中，用吸管吹打數次，300目尼龍布過濾，1 500 r/min離心5 min，收集細胞，2 ml紅細胞裂解液裂解紅細胞，用PBS緩沖液洗3遍，計數，調整細胞濃度2×106/ml，96孔細胞培養板每孔取100 μl細胞懸液，加100 μl含10%新生牛血清及青、鏈霉素的RPMI-1640培養基，每份標本重復6個孔，其中3個為試驗孔，每孔加20 μl脂多糖，另外3個為對照孔。置培養箱中在飽和濕度5%二氧化碳(CO2)、37 ℃條件下，培養48 h，加入MTT 10 μl，避光培養4 h；離心(400 g，10 min)，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl，于酶標儀上測定波長為570 nm時的吸光度值(A570)。計算脾淋巴細胞刺激指數(SI)=A試驗孔/A對照孔[8]。

2 結果

2.1 造模初始造模組血糖水平為(18.8±3.8)mmol/L，較正常對照組血糖水平(5.6±1.0)mmol/L升高，差異有統計學意義(t=3.15，P<0.01)，說明造模成功。且模型組血糖水平為(18.8±3.8)mmol/L、多糖低劑量組為(18.5±3.2)mmol/L、多糖中劑量組為(18.5±2.5)mmol/L、多糖高劑量組為(18.4±2.7)mmol/L，4組比較，差異無統計學意義(F=0.291，P>0.05)，具有可比性。

2.2 不同時間點血糖水平的比較 4組大鼠在第2周和第4周血糖水平的比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。第2周和第4周多糖組血糖水平均較模型組降低(P<0.01)，但多糖組兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 各組大鼠不同時間點血糖水平比較

注：與模型組比較，*P<0.01

2.3 4周后脾臟指數、胸腺指數和SI的比較 4組大鼠4周后胸腺指數和SI的比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。多糖組的胸腺指數和SI均較模型組升高(P<0.01)，且多糖中劑量組和多糖高劑量組的SI均較多糖低劑量組高，差異有統計學意義(P<0.01，見表2)。

Table2 Comparison of spleen index，thymus index，spleen lymphocyte stimulation indices in each group

組別只數脾臟指數(mg/g)胸腺指數(mg/g)SI模型組120.38±0.080.47±0.07 0.74±0.18 多糖低劑量組120.42±0.080.95±0.18*0.93±0.32* 多糖中劑量組120.44±0.061.30±0.24*1.22±0.19*☆ 多糖高劑量組120.45±0.101.14±0.15*1.24±0.24*☆★F值2.39672.72716.779P值0.0810.0000.000

注：SI=脾淋巴細胞刺激指數；與模型組比較，*P<0.01；與多糖低劑量組比較，☆P<0.01；與多糖中劑量組比較，★P<0.01

2.4 4周后外周血T淋巴細胞值的比較 4組大鼠4周后外周血T淋巴細胞CD3、CD4、CD8及CD4/CD8值的比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。多糖組的CD3、CD4及CD4/CD8值均較模型組升高(P<0.01)；多糖組的CD8值較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of peripheral blood T lymphocyte CD3，CD4，CD8and CD4/CD8in each group

組別只數CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD4/CD8模型組1248.5±10.8 33.2±11.7 26.4±6.2 1.7±0.3 多糖低劑量組1261.0±15.9*44.4±16.7*21.2±3.4*2.1±0.3* 多糖中劑量組1263.6±20.1*44.4±13.5*20.5±5.5*2.2±0.4* 多糖高劑量組1267.2±19.5*47.3±15.8*19.9±6.0*2.4±0.4*☆★F值3.6062.8524.5529.838P值0.0210.0480.0070.000

注：與模型組比較，*P<0.01；與多糖低劑量組比較，☆P<0.05；與多糖中劑量組比較，★P<0.05

3 討論

胸腺是T淋巴細胞分化和發育的場所，是機體重要的中樞免疫器官。脾臟是最大的淋巴器官，也是重要的外周免疫器官之一，含有大量的T淋巴細胞、自然殺傷細胞及淋巴因子激活的殺傷細胞等。脾臟也是對血源性抗原產生免疫應答的場所，因此，胸腺指數、脾臟指數間接反映了機體的免疫狀況[9]。本研究顯示，經枸杞多糖干預后，多糖組的胸腺指數和SI均顯著升高，且中、高劑量的枸杞多糖較低劑量的枸杞多糖更有利于改善SI。

綜上所述，枸杞多糖可在一定程度上提高糖尿病大鼠的胸腺指數和SI，改善糖尿病大鼠外周血T淋巴細胞CD3、CD4及CD8亞群比例。而枸杞多糖降血糖功效與提高免疫力之間是否存在某種關聯，還有待于進一步研究。

1 趙蕊，李青旺，張冰梅.枸杞多糖-4a改善糖尿病大鼠胰島素抵抗作用的研究[J].中國畜牧獸醫，2009，36(9)：37-42.

2 劉宏婧，李宏輝，張焱，等.枸杞多糖對糖尿病雄性大鼠生殖損傷的保護作用[J].時珍國醫國藥，2011，22(9)：2167-2168.

3 王繼紅，劉學政，那東波.枸杞多糖對糖尿病視網膜病變保護作用的研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2010，12(6)：47-49.

4 侯陽，劉學政，王繼紅.枸杞多糖對糖尿病大鼠血糖水平、血脂及血-視網膜屏障通透性的影響[J].中華實驗眼科雜志，2011，29(11)：964-967.

5 王妲.糖尿病與感染[J].中華內科雜志，1997，36(10)：716-717.

6 趙云芳，李曉冰，李瑞琴，等.降壓調脂膠囊對糖尿病早期腎損害模型大鼠NOS和ET-1表達的影響[J].中成藥，2009，31(4)：523-526.

7 趙云芳，耿宏偉，李瑞琴，等.降壓調脂膠囊對糖尿病早期腎損害大鼠PKC和TGF-β1表達的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志，2011，17(3)：284-286.

8 張旭，張國蓉，車偉，等.膠原蛋白多肽-鉻螯合物對糖尿病小鼠免疫力的影響[J].中國實驗動物學報，2008，16(1)：10-13.

9 李淑子，金在久，張善玉.澤瀉不同提取物對高脂血癥小鼠血脂及脂質過氧化的影響[J].中國實用醫藥，2008，3(32)：9.

10 Woodland DL.Cell-mediated immunity to respiratory virus infections [J].Curr Opin Immunol，2003，15(4)：430.

11 趙宏艷.靈芝多糖對H22荷瘤小鼠腸道黏膜免疫功能的影響[D].中國中醫科學院，2008.