促紅細胞生成素衍生肽對順鉑所致大鼠急性腎損傷的劑量反應關系的探討

柴 璐，王 鋒，范亞平， 楊斌，徐玉音，周建萍

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的兩大基本病理原因是缺血與腎毒性損傷。隨著多種新型藥物如抗腫瘤藥物、抗生素、非甾體抗炎藥等藥物的應用，藥物引起的AKI越來越得到重視。國內外已經對腎毒性損傷所致AKI進行了廣泛研究。已有前期的研究結果顯示人工合成的新型促紅細胞生成素衍生肽(HBSP)對缺血再灌注所致AKI大鼠具有較好的腎臟保護作用[1]，但其使用劑量與腎臟保護作用效果的關系，目前罕有報道。本研究探討HBSP對順鉑所致AKI是否有腎臟保護作用及其劑量反應關系，為臨床治療提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性6月齡SD大鼠,SPF級,體質量200～220 g,85只,由南通大學實驗動物中心提供，動物使用符合江蘇省動物管理委員會管理條例規定，實驗者獲得江蘇省實驗動物從業人員崗位證書。大鼠自由攝食和飲水,室溫20～26 ℃,濕度40%～70%,光照條件:12 h明/12 h暗。

1.2 主要試劑 HBSP(上海科肽生物科技有限公司,純度:98.12%)，順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司,產品批號：120804，規格：6 ml/30 mg,生成日期：2012-08-28)，TUNEL試劑盒(瑞士Roche，產品批號：11684817910，生成日期：2012-09-04)。

1.3 動物模型與分組 按隨機數字表將SD大鼠分為5組，分別為：對照組(5只)、順鉑組(20只)、HBSP(8 nmol/kg)組(20只)、HBSP(16 nmol/kg)組(20只)、HBSP(32 nmol/kg)組(20只)。除對照組外其他各組又分為第1、3、5、7天各亞組，每亞組5只。對照組5只大鼠腹腔單次注射0.9%氯化鈉溶液7 ml/kg。將順鉑用0.9%氯化鈉溶液配成1 mg/ml溶液，順鉑組20只大鼠腹腔單次注射順鉑7 ml/kg。HBSP(8 nmol/kg)組20只大鼠、HBSP(16 nmol/kg)組20只大鼠、HBSP(32 nmol/kg)組20只大鼠首次靜脈注射各對應劑量的HBSP，5 h后腹腔單次注射順鉑7 ml/kg，后每隔24 h均靜脈注射各亞組對應劑量的HBSP。所有大鼠予以標準飼料喂養，自由飲水。

1.4 檢測方法 全自動生化分析儀測定大鼠血尿素氮及血肌酐。大鼠腎組織采用4%多聚甲醛固定，后行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腎小管病理改變。采用TUNEL法觀察腎小管上皮細胞凋亡情況，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，以陽性細胞占細胞總數百分比雙盲法評分表示凋亡程度。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能指標的改變 各組大鼠不同時間血尿素氮及肌酐水平比較，差異均有統計學意義(尿素氮：F組間=441.456，F時間=10.643，P<0.001；肌酐：F組間=417.933，F時間=9.412，P<0.000 1)；其中第1、3、5、7天順鉑組、HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組血尿素氮及肌酐水平較對照組均增高，差異有統計學意義(P<0.05)；HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組血尿素氮及肌酐水平較順鉑組均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；HBSP(16 nmol/kg)組第7天血尿素氮及肌酐水平較HBSP(8 nmol/kg)組均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；HBSP(32 nmol/kg)第5天、第7天血尿素氮及肌酐水平較HBSP(8 nmol/kg)組和HBSP(16 nmol/kg)組均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、2)。

2.2 各組大鼠血紅蛋白的改變 各組大鼠不同時間血紅蛋白水平比較，差異無統計學意義(F組間=566 645.213，F時間=1.581，P=0.200,見表3)。

2.3 各組大鼠腎組織病理學比較 HE染色可見對照組大鼠腎組織病理學正常(見圖1)。順鉑組大鼠腎皮質損傷，腎小球輕度腫大，近端腎小管上皮細胞出現腫脹并有空泡形成，并有小管上皮細胞脫落，透明管型形成，至第3天損傷達到頂峰，后腎組織損傷逐漸減輕，至第7天有腎小管再生現象(小管上皮細胞扁平，管腔擴張，細胞核排列紊亂)(見圖2)。HBSP(8 nmol/kg)、HBSP(16 nmol/kg)、HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎組織損傷明顯減輕，第3天時管腔稍有腫脹，小管上皮細胞脫落不明顯，可見少量透明管型和紅細胞管型。在第5天時腎組織損傷程度進一步減輕，已出現腎小管再生現象(小管上皮細胞扁平，管腔擴張，細胞核排列紊亂)，且隨著HBSP劑量的加大，小管再生現象愈加明顯，至第7天時，上述3組的腎組織已基本同于對照組腎臟病理(見圖3～5)。

表1 各組大鼠不同時間血尿素氮水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與HBSP(8 nmol/kg)組比較，▲P<0.05；與HBSP(16 nmol/kg)組比較，●P<0.05

表2 各組大鼠不同時間血肌酐水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與HBSP(8 nmol/kg)組比較，▲P<0.05；與HBSP(16 nmol/kg)組比較，●P<0.05

圖2 順鉑組腎組織病理學(HE染色，×400)圖3 HBSP(8 nmol/kg)組腎組織病理學(HE染色，×400)

Figure2 Renal tissue pathological section in cisplatin groupFigure3 Renal tissue pathological section in HBSP(8 nmol/kg)group

圖4 HBSP(16 nmol/kg)組腎組織病理學(HE染色，×400)圖5 HBSP(32 nmol/kg)組腎組織病理學(HE染色，×400)

Figure4 Renal tissue pathological section in HBSP(16 nmol/kg)groupFigure5 Renal tissue pathological section in HBSP(32 nmol/kg)group

Table3 Comparison of serum hemoglobin levels at different time points among various rat groups

組別只數實驗前第1天第3天第5天第7天對照組5139±14139±14139±14139±14139±14順鉑組5141±14135±11139±13140±15137±12HBSP(8nmol/kg)組5135±13133±13139±15139±13142±13HBSP(16nmol/kg)組5143±14136±14133±13133±14139±13HBSP(32nmol/kg)組5140±13134±14130±13131±13136±14

2.4 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況 各組大鼠不同時間腎組織TUNEL染色百分比比較，差異有統計學意義(F組間=226.100，F時間=9.553，P<0.001)；其中第1、3、5、7天順鉑組、HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎組織TUNEL染色百分比較對照組均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組較順鉑組均降低(P<0.05)；HBSP(16 nmol/kg)組第7天較HBSP(8 nmol/kg)組降低(P<0.05)；HBSP(32 nmol/kg)組第5天較HBSP(8 nmol/kg)組、第7天較HBSP(8 nmol/kg)組和HBSP(16 nmol/kg)組均降低(P<0.05，見表4)。對照組可見腎小管上皮細胞細胞核排列整齊，無深褐色TUNEL染色陽性細胞(見圖6)。順鉑組在第3天時可見腎小管管腔重度改變，腎小管上皮細胞重度裸露，TUNEL染色陽性細胞較多，至第5天、第7天腎小管管腔擴張減少，TUNEL染色陽性細胞顯著減少(見圖7)。HBSP(8 nmol/kg)、HBSP(16 nmol/kg)、HBSP(32 nmol/kg)組第3天均可見較多TUNEL染色陽性細胞，在第5天、第7天時均有明顯減少，且隨著HBSP劑量的加大，TUNEL陽性細胞減少趨勢愈加明顯(見圖8～10)。

圖1 對照組腎組織病理學(HE染色，×400)

表4 各組大鼠不同時間腎組織TUNEL染色百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與HBSP(8 nmol/kg)組比較，▲P<0.05；與HBSP(16 nmol/kg)組比較，●P<0.05

圖7 順鉑組腎組織病理學(TUNEL染色，×400)圖8 HBSP(8 nmol/kg)組腎組織病理學(TUNEL染色，×400)

Figure7 Renal tissue pathological section in cisplatin groupFigure8 Renal tissue pathological section in HBSP(8 nmol/kg)group

圖9 HBSP(16 nmol/kg)組腎組織病理學(TUNEL染色，×400)圖10 HBSP(32 nmol/kg)組腎組織病理學(TUNEL染色，×400)

Figure9 Renal tissue pathological section in HBSP(16 nmol/kg)groupFigure10 Renal tissue pathological section in HBSP(32 nmol/kg)group

圖6 對照組腎組織病理學(TUNEL染色，×400)

3 討論

流行病學調查顯示AKI的發生率不斷升高，且病死率依然居高不下，盡管對AKI的了解和認識不斷增多和深入，支持或輔助的治療措施也有進展，但AKI的預后仍惡劣，特別是缺乏早期特異有效的干預和治療措施。

隨著大量新型藥物如抗腫瘤藥物、抗生素、生物制劑在臨床上的廣泛應用，藥物引起的AKI呈逐漸上升趨勢，腎中毒已經成為AKI的重要因素，國內外已經對腎毒性損傷所致AKI進行了廣泛研究。順鉑是一種細胞增殖抑制劑,廣泛用于睪丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、骨癌和頭頸癌等實體腫瘤的治療。順鉑的抗腫瘤效率高，但同時具有明顯的劑量依賴性腎毒性[2]，以腎小球與腎小管均受損為特征，主要表現為氮質血癥、多尿和腎衰竭等。本實驗采用順鉑誘導的AKI大鼠模型,該動物模型有成模時間短、成功率高、實驗操作簡單等優點，現已廣泛應用于各種有關AKI的研究中[3]。

近年來研究發現促紅細胞生成素(EPO)對順鉑所致AKI的腎臟有保護作用，其機制可能與其抗氧化應激及抗炎、抑制細胞凋亡的作用有關[4-5]。但根據多種動物和臨床實驗，啟動EPO組織保護作用需要較高的劑量，而由此產生的促紅細胞生成及血栓形成的不良反應已限制了其在臨床上的廣泛應用。研究發現腎臟及其他多種器官存在一種保護性的β共同體(β common recptor，βcR)，其能與EPO受體(EPOR)形成異源二聚體，不啟動造血信號的轉導，但可減輕炎癥反應，抑制細胞凋亡，發揮組織保護作用[6]。Brines等[7]對EPO的蛋白分子結構及其受體進行了研究，表明EPO由4個螺旋結構(Helix A～D)連接成環，當EPO與其同源二聚受體結合時，Helix B的親水表面并不與其接觸，且其不含賴氨酸，不能被氨甲酰化，不能與EPOR結合而發揮促紅細胞生成的作用，即證實βcR的配體為Helix B，研究者隨即在Helix B螺旋親水表面上挑選出11個氨基酸殘基，人工合成線性多肽鏈HBSP，達到了其發揮組織保護作用和促紅細胞生成作用分離的目的。國內外研究發現HBSP可減輕炎癥反應及抑制腎小管上皮細胞凋亡，對腎臟缺血再灌注的腎功能損傷有明顯的保護作用[8-9]。

已有研究證實了HBSP對缺血再灌注所致AKI的保護作用，對AKI大鼠采用8 nmol/kg劑量重復靜脈注射HBSP[1]，但相同劑量乃至更高劑量的HBSP對順鉑所致的AKI大鼠靜脈注射能否帶來更好的腎臟保護作用，目前罕有報道。本實驗采用大劑量(16 nmol/kg、32 nmol/kg)、多次注射(每隔24 h重復靜脈注射)的方法盡可能使HBSP穩定地發揮出腎功能保護作用。各組大鼠腎組織HE染色顯示：與順鉑組大鼠腎組織相比，HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎小管損傷明顯減輕，提示HBSP對順鉑所致AKI有保護作用。且本實驗證實各種劑量的HBSP對血紅蛋白無明顯生成作用，這一點正是HBSP優于EPO的方面。大鼠腎組織TUNEL染色百分比結果顯示與HBSP(8 nmol/kg)組相比，HBSP(16 nmol/kg)組于第1天、第3天、第5天有所降低，但無差異，于第7天降低；HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎組織TUNEL染色百分比于第1天、第3天有所降低，但無差異，第5天、第7天降低。該結果顯示HBSP的劑量使用越大，其發揮腎功能保護作用越明顯，可縮短其腎功能恢復的時間，提示HBSP使用劑量與順鉑所致AKI的腎臟保護作用可能存在正相關關系，其機制考慮可能與HBSP的劑量加大，其在循環系統中的有效濃度時間延長有關。

綜上所述，HBSP是一種新型的腎功能保護藥物，其作用機制以及使用方法還有待于進一步的研究來確定，其突出的組織保護作用和較小的不良反應為藥物導致AKI的治療開辟了新的治療思路和途徑，為藥物治療AKI帶來廣闊的應用前景。

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7 Brines M,Patel NS,Villa P,et al.Nonerythropoietic,tissue-protective peptides derived from the tertiary structure of erythropoietin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(31):10925-10930.

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9 Patel NS,Kerr-Peterson HL,Brines M,et al.Delayed administration of pyroglutamate helix B surface peptide (pHBSP),a novel nonerythropoietic analog of erythropoietin,attenuates acute kidney injury[J].Mol Med,2012,18(1):719-727.