小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對HERG通道表達的影響

魏婷，梁喆，金彥，張麗

[摘要] 目的：利用免疫熒光化學染色法和Western blot法分別定性、定量地檢測不同濃度的小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對穩定轉染在HEK-293細胞中HERG鉀通道表達的影響，以及不同濃度的小檗堿對大鼠心肌組織I_Kr通道蛋白表達的影響，探討小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿的抗心律失常機制。方法：Western blot法檢測HERG-HEK細胞上HERG通道蛋白的表達；免疫熒光化學染色法并利用共聚焦顯微鏡定性測定不同濃度的小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對HERG通道蛋白表達的影響；Western blot法定量檢測不同濃度的小檗堿對大鼠心肌組織I_Kr通道蛋白表達的影響以及小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對穩定轉染在HEK-293細胞中HERG鉀通道蛋白表達的影響。結果：Western blot法檢測穩定轉染有HERG基因的HEK293細胞能高水平的表達HERG通道蛋白。10，30 μmol·L^-1的小檗堿明顯抑制HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達（P<0.01）。10，20 mg·kg^-1的小檗堿抑制大鼠心肌組織I_Kr通道蛋白的表達（P<0.05）。3，10，30 μmol·L^-1的蓮心堿促進HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達（P<0.05）。甲基蓮心堿不影響HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達。結論：穩定轉染的HERG-HEK細胞能高水平的表達HERG通道蛋白；小檗堿對體外HERG-HEK細胞和大鼠心肌組織I_Kr通道的蛋白表達均有抑制作用；蓮心堿促進HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達；甲基蓮心堿對HERG通道蛋白表達無影響。

[關鍵詞] 小檗堿；蓮心堿；甲基蓮心堿； HERG通道；心律失常

HERG基因 （human ether a-go-go-related gene） 編碼心臟快速激活延遲整流鉀電流I_Kr的α亞基，該基因調控I_Kr通道，在心肌細胞的復極化過程中發揮重要作用。研究表明，HERG通道既是抗心律失常藥物作用的最佳靶點也是產生致命性心律失常的分子靶點。HERG缺陷可引起先天性長QT綜合癥（LQTS）[1]，同時某些藥物通過阻斷該通道、抑制HERG的蛋白表達可引起獲得性LQTS[2-3]。異喹啉類生物堿小檗堿（berberine，Ber）、蓮心堿（liensinine，Lie）、甲基蓮心堿 （neferine， Nef）對心血管系統具有多種藥理作用，在對抗多種實驗性心律失常方面效果顯著。本實驗采用細胞培養以及分子生物學技術初步研究小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對HERG通道蛋白表達的影響，并進一步分析其抗心律失常的分子、離子機制及其是否引起LQTS的副作用，為更深一步研究藥物作用位點及其與通道的構效關系、有效治療LQT綜合征及其他相關的心律失常奠定基礎。

1 材料

1.1 藥物與試藥 小檗堿購自中國食品藥品檢定研究院；蓮心堿、甲基蓮心堿購自中山康之源科技有限公司；胎牛血清購自中國醫學科學院生物工程研究所；DMEM培養基購自Hyclone公司；抗HERG的多克隆抗體（兔、山羊）購自Santa Cruz生物技術公司；紅外熒光標記的二抗（Alexa Fluor 488， Alexa Fluor 700，Alexa Fluor 680）購自Molecular Probes公司。

1.2 細胞 HEK293細胞購于中國協和醫科大學，穩定轉染有 HERG通道的HEK293細胞由加拿大蒙特利爾心臟研究中心王志國教授惠贈。

1.3 儀器 IX-70相差倒置顯微鏡（Olympus公司）；熒光顯微鏡及彩色照相系統（日本尼康公司）；Odyssey紅外熒光掃描系統（LI-COR公司）；MiniRun GE-100凝膠電泳儀；電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 HERG-HEK細胞培養于含有10%胎牛血清和400 μmol·L^-1G418的DMEM培養基中，HEK293細胞培養于上述不含G418的培養液中，37 ℃，5%CO2₂ 飽和濕度孵箱培養。經過消化傳代，取處于對數生長期的細胞進行培養。

2.2 免疫細胞熒光染色檢測小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對HERG蛋白表達的影響 取對數生長期的HERG-HEK細胞稀釋至鋪有蓋玻片的6孔板中培養。待細胞爬片貼壁后，分別以空白培養基和含終濃度為1，3，10，30 μmol·L^-1的小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿的培養基孵育HERG-HEK細胞48 h，依次進行固定、穿透、封閉[4]，一抗（抗HERG的兔抗體，1∶200）4 ℃孵育過夜，復溫后用PBS沖洗3次，每次5 min，加入FITC標記的羊抗兔二抗 （1∶200），避光室溫反應2 h。用PBS沖洗3次后利用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.3 Western blot檢測小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿對穩定轉染有HERG基因的HEK293細胞中HERG蛋白表達的影響 將處于對數生長期的HERG-HEK細胞分別以空白培養基和含終濃度為1，3，10，30 μmol·L^-1的小檗堿、蓮心堿和甲基蓮心堿的培養基孵育48 h（24 h更換1次含有上述藥物的新鮮培養基）。用預冷的PBS收集細胞并提取總蛋白，用Brad-ford法進行蛋白定量。取等量樣品，加入等體積的5×上樣緩沖液后，煮樣、電泳、轉膜、封閉[4]，加入一抗（抗HERG的兔抗體，1∶200），室溫孵育1.5 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，然后用紅外熒光標記二抗（羊抗兔Alexa Fluor 700二抗，1∶4 000）對膜室溫避光孵育1 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，再用PBS洗膜15 min，洗去聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（Tween-20）以降低背景，以上過程均需避光。洗膜后用Odyssey紅外熒光掃描系統檢測，以GAPDH作內參，用圖像分析軟件Scion Image進行吸光度積分值分析。

2.4 Western blot檢測小檗堿對大鼠心肌組織I_Kr通道蛋白表達的影響 將大鼠分為空白對照組，5，10，20 mg·L^-1加藥組，分別尾靜脈注射生理鹽水和相應濃度的小檗堿溶液，24 h后，取心肌組織并提取組織膜蛋白，測定膜蛋白濃度，放置于-80 ℃超低溫冰箱中待用。取等量樣品，加入等體積的5×上樣緩沖液后，煮樣、電泳、轉膜、封閉[4]，加入一抗（多克隆羊抗體1∶200），室溫孵育1.5 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，然后用紅外熒光標記的二抗（驢抗山羊IgG Alexa Fluor 680，1∶4 000），避光孵育1 h，用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，再用PBS洗膜15 min，洗去Tween-20以降低背景，以上過程均需避光。Odyssey紅外熒光掃描成像系統對膜上蛋白質進行檢測，用圖像分析軟件Scion Image進行吸光度積分值分析。

2.5 統計學處理 實驗數據以 ±s表示，采用Students′t檢驗進行統計學檢驗。

3 結果

3.1 穩定轉染的HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達 培養HEK293細胞及穩定轉染的HERG-HEK細胞，提取總蛋白，用針對N末端的HERG通道蛋白的抗體作為一抗，通過Western blot 分析檢測HERG通道蛋白的表達。實驗結果顯示HEK293細胞中沒有HERG鉀通道蛋白的表達，而HERG-HEK細胞中存在HERG鉀通道蛋白的表達，并且發現2條帶（圖1）。

3.2 小檗堿對HERG-HEK細胞中HERG蛋白表達的影響 分別用1，3，10，30 μmol·L^-1的小檗堿孵育HERG-HEK細胞24 h后進行Western blot檢測，結果發現小檗堿（10，30 μmol·L^-1）顯著抑制HERG鉀通道蛋白的表達（P<0.01）（圖2）。

與對照組相比1）P<0.05，2）P<0.01（圖4，5同）。

通過免疫熒光染色法利用激光共聚焦顯微鏡觀察，小檗堿（10，30 μmol·L^-1）孵育后細胞膜上的熒光強度明顯低于對照組，與Western blot的結果相一致（圖3）。

3.3 小檗堿對大鼠心肌組織中HERG蛋白表達的影響 分別用生理鹽水，5，10，20 mg·kg^-1的小檗堿溶液尾靜脈注射大鼠，24 h后取心肌組織提取組織膜蛋白，進行Western blot分析。結果顯示，小檗堿（10，20 mg·kg^-1）可以抑制HERG鉀通道蛋白的表達（P<0.05） （圖4）。

3.4 蓮心堿對HERG-HEK細胞中HERG鉀通道蛋白表達的影響 分別用1，3，10，30 μmol·L^-1的蓮心堿孵育HERG-HEK細胞24 h后進行Western blot檢測，結果發現蓮心堿（3，10，30 μmol·L^-1）可以促進HERG鉀通道蛋白的表達（P<0.05）（圖5）。

通過免疫熒光染色法利用激光共聚焦顯微鏡觀察，發現高亮度綠色熒光位于細胞膜上，細胞漿中特異性綠色熒光微弱，提示HERG鉀通道蛋白主要定位在細胞膜上，并且蓮心堿（3，10，30 μmol·L^-1）孵育后細胞膜上的熒光強度明顯高于對照組，與Western blot的結果相一致（圖6）。

3.5 甲基蓮心堿對HERG-HEK細胞中HERG鉀通道蛋白表達的影響 用含有不同濃度的甲基蓮心堿的培養液孵育HERG-HEK細胞24 h后，進行Western blot分析。結果顯示，各組之間均無顯著性差異（圖7）。

免疫熒光結果顯示各組之間熒光亮度無明顯差異，與Western blot的結果相一致（圖8）。

4 討論

HERG是鉀通道的編碼基因，它所表達的離子通道正是多數Ⅲ類抗心律失常藥的作用靶點[5]，其生物物理學特性及藥理學特性與I_Kr相似。研究發現，某些抗心律失常藥物以及非抗心律失常藥物均可通過阻斷HERG通道使患者心電圖上出現QT間期延長的表現，嚴重者甚至可以引起猝死[6-7]，其中抗瘧原蟲藥pentamidine是通過影響HERG通道的蛋白表達而引發心律失常的[8]。由此可見，HERG通道既是抗心律失常藥物作用的最佳靶點也是產生致命性心律失常的分子靶點，因此通過對HERG通道的研究將有助于開發更安全、高效的抗心律失常藥物。

4.1 小檗堿對HERG通道的影響 小檗堿對心臟有正性肌力和負性頻率作用，可以對抗哇巴因、氯化膽堿和氯化鈣等藥物以及冠脈結扎、缺血-再灌注等所致的大鼠實驗性心律失常[9]，臨床上小檗堿對室性、室上性心律失常有較好的治療作用。近期還發現小檗堿對大鼠心肌肥厚模型也有改善作用[10]，這些都說明小檗堿抗心律失常的分子靶點是多方面的。研究表明，小檗堿可以作用于HERG鉀通道，顯著延長動作電位時程，并抑制HERG鉀通道電流[11]，并有文獻進一步研究了小檗堿作用于HERG鉀通道的分子位點[12]，說明小檗堿對HERG通道的影響很可能是其抗心律失常的作用機制之一。

本實驗使用針對N末端的HERG通道蛋白抗體作為一抗，經Western blot分析，發現存在2條帶，其中155 kDa的蛋白為HERG通道完全糖基化形式，即該通道的成熟形式，主要定位于細胞膜上；而135 kDa的蛋白為HERG通道核心糖基化的形式，即成熟通道的前體，主要存在于內質網和高爾基復合體中[13]。HERG通道蛋白屬于N連接糖蛋白，在細胞外的部分存在2個糖基化的位點 （N598，N629），研究表明N連接糖基化與HERG通道的穩定性有密切關系，控制蛋白質的折疊、運輸、修飾、以及使其免受蛋白酶的降解[14]。

近年來研究證明某些藥物不但對體外轉染有HERG通道的細胞蛋白表達有作用，還對新生乳鼠體內的心肌細胞HERG蛋白表達有一定作用[15]，為從體外體內2個方面驗證藥物對HERG通道的作用奠定了基礎。本實驗從蛋白水平上研究了小檗堿對HERG鉀通道表達的影響，體外HERG-HEK細胞和大鼠心肌組織的HERG蛋白表達結果均顯示，小檗堿可以降低HERG鉀通道蛋白的完全糖基化形式，抑制HERG鉀通道膜蛋白的表達和成熟，從而從體內和體外2個方面確定了小檗堿對HERG通道蛋白表達的作用。但HERG-HEK細胞中10，30 μmol·L^-1組間以及大鼠心肌組織中10，20 mg·kg^-1組間統計均無明顯差異，所以小檗堿對HERG鉀通道膜蛋白的抑制作用沒有明顯的濃度依賴性。

本實驗研究首次從蛋白水平上完善了小檗堿對HERG鉀通道作用的全面研究，并初步分析了其抗心律失常的分子機制，為小檗堿的臨床應用和安全性提供了理論依據。但小檗堿降低HERG鉀通道完全糖基化蛋白的作用是否具有生理學功能還需進一步研究，從而可以更加系統和具體的闡明小檗堿抗心律失常的離子機制，為提高其臨床應用價值提供理論依據。

4.2 蓮心堿對HERG通道的影響 蓮心堿是蓮子心中的一種含量較高的酚性生物堿，現代研究表明其具有降壓，減慢心率，抑制心肌收縮力，抗心律失常等作用[16]。蓮心堿能減慢心率， 使心室舒張期延長， 有利于血液從心外膜區向內膜區灌注， 改善缺血缺氧；抑制心肌收縮， 降低后負荷，從而降低了心肌耗氧量，有利于抗心律失常作用發揮[17]。蓮心堿對心肌慢反應動作電位及慢內向電流有影響，10～100 μmol·L^-1可濃度依賴性降低離體兔竇房結起搏細胞慢反應動作電位幅度及零相最大上升速率，延長竇性周長，同濃度下， 其作用強于奎尼丁；蓮心堿1～100 μmol·L^-1可濃度依賴性抑制犬浦肯野氏纖維慢向內流；蓮心堿還可對抗乙酰膽堿縮短動作電位時程的作用， 這些都提示蓮心堿對Na+ ，K+ ，Ca2 +的跨膜轉運均有抑制作用[18-19]。

本實驗研究中Western blot的結果為經過3，10，30 μmol·L^-1蓮心堿處理HERG-HEK細胞48 h后HERG通道完全糖基化的形式即成熟HERG通道的表達明顯增加，同時，免疫熒光化學染色結果顯示細胞膜上的熒光強度明顯增強，說明定位在細胞膜上的成熟的HERG通道蛋白增加了，即中高濃度的蓮心堿可以促進HERG通道蛋白在細胞膜上的表達和成熟，這就避免了因長時間應用蓮心堿所引起的LQTS副作用，并且可以彌補由于HERG通道被阻斷而引起的相對不足，提示中高濃度的蓮心堿可以成為潛在的治療LQTS的藥物之一。通過對HERG通道蛋白核心糖基化形式的分析發現各組之間沒有顯著性差異，說明蓮心堿在蛋白的運輸過程中起作用，但其影響蛋白的修飾加工、運送至細胞膜的一步或幾步還有待進一步研究。

4.3 甲基蓮心堿對HERG通道的影響 本實驗用不同濃度甲基蓮心堿作用于穩定轉染的HERG-HEK細胞，Western blot和免疫熒光化學染色的結果均顯示甲基蓮心堿對HERG通道蛋白的表達無明顯影響，說明甲基蓮心堿不會阻礙HERG通道蛋白的生成與轉運，為甲基蓮心堿的安全性提供了理論支持，但其具體電生理學方面的機制還有待于進一步完善。

從蓮心堿和甲基蓮心堿對HERG通道蛋白的表達的影響中可以看出，在3，10，30 μmol·L^-1的蓮心堿作用下，HERG蛋白表達的量是增加的，但是缺乏劑量依賴性，而甲基蓮心堿作用后，HERG蛋白表達的量無明顯改變。可能是由于甲基蓮心堿比蓮心堿多一個甲基，從而改變了藥物分子的極性，穩定性，也因此改變了其作用機制及療效。

綜上所述，穩定轉染有HERG基因的HEK293細胞能高水平的表達HERG通道蛋白。10，30 μmol·L^-1的小檗堿顯著抑制穩定轉染的HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達，但無明顯劑量依賴性。10，20 mg·kg^-1的小檗堿抑制大鼠心肌組織I_Kr通道蛋白的表達。3，10，30 μmol·L^-1的蓮心堿促進穩定轉染的HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達，但無明顯劑量依賴性。甲基蓮心堿不影響穩定轉染的HERG-HEK細胞中HERG通道蛋白的表達。

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Effect of berberine， liensinine and neferine on HERG channel expression

WEI Ting*， LIANG Zhe， JIN Yan， ZHANG Li

（Harbin Children′s Hospital， Harbin 150010， China）

[Abstract] Objective： Immunofluorescence and Western blot methods were adopted for qualitative and quantitative detections of the effect of different concentrations of berberine， liensinine and neferine on the expression of stable transfection in HERG potassium channel in HEK-293 cells， as well as the effect of different concentrations of berberine on protein expression of I_Kr channel in cardiac muscular tissues， in order to investigate the anti-arrhythmic mechanism of berberine， liensinine and neferine. Method： Western blot method was used to detect protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells. Immunofluorescence method as well as confocal laser microscope were used to detect the effect of different concentrations of berberine， liensinine and neferine on protein expression of HERG channel. Western blot method was used to detect the effect of different concentrations of berberine on protein expression of I_Kr channel in cardiac muscular tissues as well as the effect of berberine， liensinine and neferine on protein expression of stable transfection in HERG potassium channel in HEK-293 cells. Result： Western blot experiment manifested that stable transfection of HEK293 cells containing HERG genes could increase protein expression of HERG channel. Berberine （10， 30 μmol·L^-1） remarkably inhibited protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells （P<0.01）. Berberine （10， 20 mg·kg^-1） also inhibited protein expression of I_Kr channel in rat ventricular tissues （P<0.05）. Liensinine （3， 10， 30 μmol·L^-1） increased protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells （P<0.05）. Neferine showed no effect on protein expression of HERG channel in HERG-HEK cells. Conclusion： The stably transfection of HERG-HEK cells can increase protein expression of HERG channel. Berberine shows inhibitory effect on protein expressions of in vitro HERG-HEK cells and I_Kr channel in rat ventricular tissues. Liensinine improves protein expression of HERG channe in HERG-HEK cells. Neferine shows no effect on protein expression of HERG channel.

[Key words] berberine； neferine； liensinine； HERG channel； arrhythmia

doi：10.4268/cjcmm20130219

[責任編輯 張寧寧]