4種中藥單體對人胰腺癌PANC—1細胞移植瘤生長的影響及分子機制探討

潘會君，聶緒強，劉朵，卞卡

[摘要] 目的：研究淫羊藿次苷Ⅱ，知母皂苷AⅢ，甲基蓮心堿，紅景天苷對PANC-1移植瘤的作用。方法：建立PANC-1皮下移植瘤模型，成瘤后隨機分組，治療組給予中藥單體腹腔注射，23 d取瘤稱重，部分組織中性福爾馬林固定做免疫組化，其余組織液氮速凍，然后轉移至-80 ℃冰箱保存做基因蛋白分析。免疫組化Ki67觀察腫瘤增殖情況，RT-PCR檢測瘤組織VEGF mRNA表達情況，Western blotting檢測瘤組織VEGF蛋白表達。結果：與模型組比較，知母皂苷AⅢ（1.0 mg·kg^-1）能抑制腫瘤生長（P<0.05），能降低VEGF mRNA（P<0.05）和VEGF蛋白表達（P<0.05），活化Caspase-3蛋白。淫羊藿次苷Ⅱ，甲基蓮心堿，紅景天苷的抗腫瘤作用不顯著。結論：知母皂苷AⅢ其抗腫瘤作用與抑制VEGF及促進腫瘤凋亡有關。

[關鍵詞] 中藥單體；血管內皮生長因子；凋亡

胰腺癌是惡性程度極高的消化系腫瘤，近30年來發病率已增長3～7倍 [1]。胰腺癌致死率高，目前的化療放療仍然不能很好的治療胰腺癌。中藥在腫瘤治療過程中發揮著重要作用，因此，開發具有抗腫瘤的中藥有很大潛力。體外研究顯示，淫羊藿次苷Ⅱ誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡[2]；知母皂苷AⅢ能抑制HCT-15結腸癌細胞[3]、乳腺癌MDA-MB-231和MCF-10A細胞[4]、人宮頸癌Hela細胞[5]生長；甲基蓮心堿有腫瘤增敏劑的作用[6]；紅景天對肝癌、乳腺癌、胃癌及白血病等具有殺傷作用[7]。但體內研究報道較少。作者在前期體外篩選發現淫羊藿次苷Ⅱ，知母皂苷AⅢ，甲基蓮心堿，紅景天苷能一定程度的抑制PANC-1腫瘤細胞的生長。為了明確4種中藥單體的體內抗腫瘤作用，進行了PANC-1裸鼠皮下移植瘤實驗。

1 材料

1.1 藥物與試劑 淫羊藿次苷Ⅱ，知母皂苷AⅢ，甲基蓮心堿，紅景天苷均購自同田生物技術有限公司，純度≥98%。抗體Ki67一抗購自Abcam；抗體Caspase-3一抗購自CST；VEGF一抗購自R&D;公司。Trizol、瓊脂糖均購于上海生工公司。無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇、甲醇均為國產分析純，購自上海國藥集團。引物VEGF購自生工生物科技有限公司。MMLV和RNA酶抑制劑由Promega公司提供，TaqDNA聚合酶，dNTP，DNA標準相對分子質量購自于博大泰克公司。

1.2 動物與細胞株 裸鼠，雌性，清潔級，中國科學院上海動物中心提供。動物使用許可證號SYXK（滬）2009-0069。人胰腺癌PANC-1細胞是由美國休斯頓醫學院惠贈。

1.3 儀器 HEPA CLASS100 CO₂培養箱（美國Thermo公司）；Delta series生物安全柜（Labconco， 美國）；Eppendorf Centrifuge 5810R低溫高速離心機（德國）；PCR儀（德國Biometra公司）；GIS凝膠圖像分析系統購自上海天能科技有限公司；單向電泳系統（美國Bio-Rad公司）；sMPIC2600C自動X線膠片洗片機（上海申貝辦公機械有限公司）。

2 方法

2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 PANC-1用含10%新生牛血清（FCS）的DMEM培養基在37 ℃， 5%CO₂培養箱中培養。傳代細胞，用PBS調整細胞密度。在裸鼠左上肢腋下注射0.2 mL細胞混懸液，含2×10⁶個細胞。用游標卡尺測量腫瘤的最長徑及最短徑，根據公式V=ab²/2計算腫瘤體積，a為長徑、b為短徑。

2.2 分組及給藥 瘤長徑3～5 mm后，將裸鼠隨機分為模型組、淫羊藿次苷Ⅱ組（0.7 mg·kg^-1）、知母皂苷AⅢ組（1.0 mg·kg^-1）、甲基蓮心堿組（0.8 mg·kg^-1）、紅景天苷組（0.4 mg·kg^-1），每組6只。每隔1 d稱重，測瘤長徑，短徑。每天腹腔注射中藥單體，23 d處死動物，取瘤稱重，組織切塊液氮速凍，然后轉移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 免疫組化 石蠟包埋，切片，脫蠟和水化。滴加正常兔血清封閉液，室溫20 min甩去多余液體。滴加一抗Ki67，濃度1∶50，4 ℃過夜。PBS洗2×3 min。滴加生物素標記二抗10 μL孵育20 min。PBS洗2×3 min。滴加試劑SABC室溫孵育20 min。PBS洗4×5 min。DAB顯色水洗終止反應。脫水透明封片鏡檢。顯微鏡下拍照。Ki67 陽性表達定位細胞核，為棕黃色，400倍光鏡下拍照觀察棕黃色反應區可以反映腫瘤細胞增殖情況。

2.4 RT-PCR檢測VEGF mRNA Trizol法提取細胞總RNA，取1 μg總RNA配置逆轉錄反應體系，逆轉錄合成cDNA，并以此為模板利用PCR方法進行擴增。VEGF正向引物5′-CAGGGTCCTCTCCCCTGCCC-3′，反向引物5′-GATGCGCGTGCAGCATGTGG-3′； Actin正向引物5′-AGCTGAGAGGAAATCGTGCG-3′， 反向引物5′-GTGCCACCAGACAGCACTGTG-3′。PCR擴增產物10 μL經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用數碼凝膠成像分析系統拍照成像分析。

2.5 Western blotting檢測VEGF，Caspase-3蛋白 稱取50～100 mg組織加入含PMSF的RIPA裂解液超聲后12 000 r·min^-1離心15 min，取上清，即為總蛋白。蛋白定量，電泳：制SDS聚丙烯酰胺凝膠，12%分離膠、7.5%積層膠，將蛋白樣品與4×上樣緩沖液按3∶1體積混合后95 ℃變性5 min，每組上樣20 μg。電泳條件：電壓80 V，時間約2 h。轉膜條件：400 mA電轉60 min。以5%脫脂奶粉/TBST溶液搖床上封閉1 h。抗原抗體反應：封閉結束后，將膜放入塑料袋中，加入一抗溶液（一抗按1∶1 000稀釋，GAPDH按1∶8 000稀釋），4 ℃過夜，第2天室溫1 h后，TBST洗滌 8 min×3次，加入相應二抗，室溫1 h，TBST 洗滌8 min×3次。等量ECL發光劑混勻后浸膜2 min，吸干后覆以保鮮膜，于片夾內曝光10～60 s，自動X線膠片洗片機顯影、定影。結果掃描后，經吸光度分析系統計算灰度值。

2.6 數據分析 采用SPSS 15.0統計軟件進行數據統計，多組計量資料采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 中藥單體對PANC-1移植瘤生長的影響 與模型組比較，知母皂苷AⅢ能明顯抑制腫瘤生長（P<0.05），而淫羊藿次苷Ⅱ、甲基蓮心堿、紅景天苷瘤體積和瘤重輕微降低但沒有顯著性差異。與模型組比較，淫羊藿次苷Ⅱ、知母皂苷AⅢ、甲基蓮心堿、紅景天苷裸鼠體重沒有明顯差異（圖1）。各用藥組和模型組未發現裸鼠死亡。

3.2 對PANC-1裸鼠瘤細胞增殖的影響 Ki67 的表達與腫瘤細胞增殖密切相關。模型組棕黃色陽性腫瘤細胞較多，知母皂苷AⅢ用藥組陽性細胞明顯減少（圖2）。

3.3 對PANC-1裸鼠瘤組織Caspase-3蛋白的影響 知母皂苷AⅢ能升高cleaved Caspase-3蛋白（圖3），說明知母皂苷AⅢ促進了腫瘤凋亡，而其余各組未發生凋亡，提示知母皂苷AⅢ的抗腫瘤作用與促進腫瘤凋亡有關。

3.4 對PANC-1裸鼠瘤組織VEGF mRNA的影響 與模型組比較，知母皂苷AⅢ組裸鼠瘤組織VEGF mRNA表達明顯降低（P<0.05）；淫羊藿次苷Ⅱ、甲基蓮心堿、紅景天苷給藥組VEGF mRNA表達有一定程度降低，但沒有顯著性差異（圖4）。

3.5 對PANC-1裸鼠瘤組織VEGF蛋白的影響 與模型組比較，知母皂苷AⅢ組VEGF蛋白表達明顯降低（P<0.05）。而淫羊藿次苷Ⅱ，甲基蓮心堿，紅景天苷給藥組能一定程度降低VEGF蛋白表達，但沒有顯著性差異（圖5）。

4 討論

血管內皮生長因子是一種有效的促進腫瘤血管生長的因子[8]。研究表明在胰腺癌細胞中存在VEGF高表達。Jane等[9]檢測多種胰腺癌細胞株，如AsPC-l，BxPC-3，CFPA，HPAF2和PANC-l均有血管內皮生長因子及其受體的表達。VEGF對于血管發生起著十分重要的作用，抗血管生成是治療腫瘤的重要策略。促進腫瘤細胞凋亡也被認為是一種治療腫瘤的策略。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。在凋亡的早期階段，活化的Caspase-3被認為是凋亡發生的早期分子標志[8]。

本實驗結果顯示知母皂苷AⅢ能明顯抑制 PANC-1移植瘤生長。免疫組化也顯示知母皂苷AⅢ抑制腫瘤生長。另外還發現，知母皂苷AⅢ的抗腫瘤作用除了抑制VEGF，還能活化Caspase-3促進腫瘤凋亡。知母皂苷AⅢ其抗腫瘤作用與抑制VEGF及促進腫瘤細胞凋亡有關。另外，淫羊藿次苷Ⅱ、甲基蓮心堿、紅景天苷抑制腫瘤作用不明顯，是否加大給藥劑量能明顯抑制腫瘤生長，尚需進一步研究。

[參考文獻]

[1] 王玉蘭，韋立新，顧倬云，等.胰腺癌伴隨炎癥的病理學研究[J].肝膽外科雜志，2008， 16（14）： 266.

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Effects of four kinds of Chinese medicine monomer on growth of PANC-1

xenograft tumor and studying of molecular mechanism

PAN Hui-jun 1， NIE Xu-qiang1， LIU Duo 1， BIAN Ka1，2*

（1.Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional

Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；

2.Division of Nitric Oxide and Inflammatory Medicine， E-Institute of Shanghai Universities， Shanghai 201203， China）

[Abstract] Objective： The antitumor effects of icarisid Ⅱ， timosaponin A-Ⅲ， neferine and salidroside were studied in PANC-1 xenograft tumor. Method： To establish of the nude mice xenograft tumor model， PANC-1 cells were injected. When the tumor major diameter was reached 3-5 mm， the treatment was initiated. The mice were randomized into vehicle control and treatment groups of six animals per each. Chinese medicine monomer was injected intraperitoneally every day. In 23th day， mice were killed once a day， tumor tissue were isolated and weighed and divided into two parts. One part was fixed with formaldehyde for tissue section and immunohistochemistry， the another of tissue was frozen in liquid nitrogen then in -80 ℃ refrigerator for gene and protein expression analysis. Result： In PANC-1 tumor xenograft experiment， compared with model group， timosaponin A-Ⅲ （1.0 mg·kg^-1） exerted significant inhibitory effects on tumor growth. Timosaponin A-Ⅲ suppressed mRNA expressions of VEGF （P<0.05）， reduced protein expressions of VEGF （P<0.05）， activated Caspase-3 protein. Icarisid Ⅱ， neferine and salidroside had not an excelled antitumor effect. Conclusion： Timosaponin A-Ⅲ exerted an excelled antitumor effect. The antitumor mechanisms include anti-angiogenesis， apoptosis promotion.

[Key words] Chinese medicine monomer； vascular endothelial growth factor； apoptosis

doi：10.4268/cjcmm20130220

[責任編輯 張寧寧]