胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血損傷后H2O2含量和CAT活性的影響

鐘亮　張睿　紀(jì)曉軍　吳藝玲　劉紅玲　黃惠

[摘要] 目的 通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化胡黃連苷Ⅱ治療大鼠腦缺血損傷的最佳劑量和時(shí)間窗。 方法 應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法（BCCAO）建立大鼠前腦缺血模型，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，經(jīng)腹腔注射胡黃連苷Ⅱ干預(yù)治療，應(yīng)用光化學(xué)法測(cè)定血清和腦組織中過(guò)氧化氫（H2O2）的含量和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。 結(jié)果 胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳效果，根據(jù)血清和腦組織中H2O2含量分析，分別為腦缺血1.5 h/（10 mg·kg）和腦缺血1.5 h/（20 mg·kg）體重。根據(jù)血清和腦組織中CAT活性分析，分別為腦缺血1.5 h/（20 mg·kg）和腦缺血1.5 h/（10 mg·kg）體重。 結(jié)論 從用藥劑量最小化和治療時(shí)間窗最大化的角度綜合評(píng)價(jià)，胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的治療時(shí)間窗和劑量最佳組合為腦缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg體重。

[關(guān)鍵詞] 胡黃連苷Ⅱ；腦缺血；劑量；時(shí)間窗；H2O2；CAT；大鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R338；R364 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）09-20-03

腦缺血損傷導(dǎo)致能量代謝障礙、線(xiàn)粒體功能異常、離子平衡失調(diào)、興奮性氨基酸釋放[1-2]，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，氧自由基產(chǎn)生和清除失衡，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[3-4]。氧自由基攻擊生物膜中的多聚不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[5-6]。自由基清除劑通過(guò)降低腦組織氧化應(yīng)激水平，踐行缺血損傷程度[7-8]。過(guò)氧化氫酶（CAT）可將H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的H2O2[9]。細(xì)胞培養(yǎng)研究證實(shí)，胡黃連苷Ⅱ可減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[10]，抑制細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的降低[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，胡黃連苷Ⅱ可抑制大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減小腦梗死體積而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用[12]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，在

大鼠腦缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg劑量胡黃連苷Ⅱ可取得最佳療效[13]。本實(shí)驗(yàn)試圖定量檢測(cè)血清和腦組織H2O2水平和CAT活性的變化，探討胡黃連苷Ⅱ在腦缺血損傷中的抗氧化作用及最佳治療劑量和時(shí)間窗。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

成年健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠30只，體重230～250 g，青島市藥物檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK20100010）。動(dòng)物置實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周，自由進(jìn)食、飲水；室溫（23±2）℃，自然光照。隨機(jī)取5只為假手術(shù)組，其余動(dòng)物分離并結(jié)扎雙側(cè)經(jīng)總動(dòng)脈建立前腦缺血模型[14]。術(shù)前動(dòng)物禁食12 h，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），仰臥固定、無(wú)菌操作，術(shù)后2 h仍未蘇醒或死亡的4只動(dòng)物動(dòng)物剔除，將成功的21只模型再隨機(jī)分為模型組5只和治療組16只。假手術(shù)組不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.2 設(shè)計(jì)分組

1.3 干預(yù)措施

胡黃連苷Ⅱ（CAS No：39012-20-9，純度>98%）由天津奎青醫(yī)藥公司提供，應(yīng)用生理鹽水溶解稀釋成1%溶液，按[L16（45）]正交表設(shè)計(jì)，在相應(yīng)的缺血時(shí)間腹腔注射相應(yīng)劑量胡黃連苷Ⅱ。假手術(shù)組和模型組術(shù)后2 h腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集

大鼠給藥24 h后，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)胸經(jīng)心臟取血4 mL，4000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存。然后立即經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL，快速開(kāi)顱，完整取腦，切除嗅球和額葉前部腦組織，自視交叉向后切取缺血部位腦組織500 mg，置預(yù)冷研缽中研磨至粉末狀后按1∶4比例加細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所），超聲波勻漿，4℃冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5801型，德國(guó)）12 000r/min離心10 min，去沉淀組織留上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，-20℃保存。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

應(yīng)用光化學(xué)方法分別測(cè)定血清或腦組織勻漿中過(guò)氧化氫（H2O2）水平和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。按試劑盒（南京建成生物公司）說(shuō)明書(shū)操作，取血清或腦組織勻漿室溫復(fù)溶，離心取上清100μL，以紫外分光光度計(jì)（Beckmann DU640，USA）在波長(zhǎng)751 nm（H2O2）和405 nm（CAT）處測(cè)定吸光度值，計(jì)算H2O2（mmol/L）含量和CAT（U/mL）活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。根據(jù)結(jié)果分析不同水平的缺血（給藥）時(shí)間和劑量以及時(shí)間-劑量交互作用對(duì)檢測(cè)指標(biāo)是否有顯著性影響，得出最佳劑量和時(shí)間窗。

2 結(jié)果

交互作用（C）均無(wú)顯著性影響（P>0.05）。應(yīng)用最小顯著差數(shù)法（LSD）對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較顯示：血清H2O2含量在給藥（缺血）時(shí)間1.0 h（A1）與1.5 h（A2）、1.0 h（A1）與2.0 h（A3）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余給藥時(shí)間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在給藥劑量5 mg（B1）與10 mg（B2）之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余給藥劑量?jī)蓛杀容^均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。從治療時(shí)間窗最大化和用藥劑量最小化的角度考慮，以A2B2最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量分別為缺血1.5 h和10 mg/kg體重。

2.3 CAT含量方差分析

不同水平的缺血時(shí)間（A）對(duì)血清CAT活性的影響有顯著性影響（P<0.01），而給藥劑量（B）和時(shí)間-劑量交互作用（C）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。LSD兩兩比較顯示：血清CAT活性在給藥（缺血）時(shí)間1.0 h（A1）與2.0 h（A3）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余給藥時(shí)間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在給藥劑量5 mg（B1）與20 mg（B3）、10 mg（B2）與40 mg（B4）、20 mg（B3）與40 mg（B4）之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余給藥劑量?jī)蓛杀容^均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。根據(jù)治療時(shí)間窗最大化和給藥劑量最小化原則，以A2B3最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量為腦缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg體重。

缺血時(shí)間（A）和給藥劑量（B）對(duì)腦組織中CAT的活性均有顯著性影響（P<0.05），而時(shí)間-劑量交互作用（C）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。LSD兩兩比較顯示：腦組織中CAT活性在給藥（缺血）時(shí)間1.0 h（A1）與2.5 h（A3）、1.5 h（A2）與2.0 h（A3）、1.5 h（A2）與2.5 h（A4）之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余給藥時(shí)間兩兩比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在給藥劑量5 mg（B1）與40 mg（B3）、10 mg（B2）與20 mg（B4）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余給藥劑量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)治療時(shí)間窗最大化和給藥劑量最小化原則，以A2B2最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量為腦缺血1.5 h腹腔注射10 mg/kg體重。

3 討論

胡黃連為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，主要生物活性成分是環(huán)烯醚萜甙類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化等作用[10]。細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，胡黃連甙Ⅱ?qū)2O2導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷也有明顯保護(hù)作用，考慮與其直接清除氧自由基及增強(qiáng)細(xì)胞本身抗氧化系統(tǒng)功能有關(guān)[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，胡黃連苷Ⅱ可保護(hù)模型大鼠神經(jīng)功能，其神經(jīng)保護(hù)作用與胡黃連苷Ⅱ提高模型大鼠腦組織的抗氧化能力、減少腦缺血再灌注所致的氧化性損傷有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)H2O2可以直接反應(yīng)出腦缺血損傷時(shí)體內(nèi)自由基含量的變化，CAT則可以體現(xiàn)腦缺血損傷時(shí)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量的變化。按[L16（45）]正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，通過(guò)檢測(cè)H2O2和CAT指標(biāo)，結(jié)果表明給藥時(shí)間和用藥劑量對(duì)于胡黃連苷Ⅱ的治療效果均有顯著性影響，不同檢測(cè)指標(biāo)最佳組合不盡一致，從用藥劑量最小化和治療時(shí)間窗最大化的角度考慮，以A2B2和A2B3組合最好，即最佳治療時(shí)間窗和劑量分別為腦缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg體重。由于腦缺血損傷的機(jī)制目前尚不十分明確，本研究?jī)H觀察了以上上述指標(biāo)的變化，難免有所偏差。因此，胡黃連苷Ⅱ的確切作用機(jī)制和最佳治療時(shí)間窗和給藥劑量尚有待于進(jìn)一步綜合評(píng)價(jià)。

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（收稿日期：2013-04-17）