精源性雙酚A對(duì)小鼠體外受精和胚胎發(fā)育的影響

楊愛軍　韓偉　劉莊　王雪楠

[摘要] 目的 探討雙酚A（BPA）對(duì)小鼠體外受精和胚胎發(fā)育的精源性影響作用。 方法 健康昆明種小鼠52只，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組雄鼠用雙酚A[10 μg/（kg·d）]胃灌洗45 d后進(jìn)行精子參數(shù)分析，同時(shí)取出正常喂養(yǎng)的雌鼠卵子進(jìn)行體外受精，對(duì)受精情況、胚胎發(fā)育情況進(jìn)行跟蹤觀察，對(duì)照組雄鼠采用相同體積的玉米油胃灌洗。 結(jié)果 （1）雙酚A灌洗組精子的活力33.15%顯著低于正常組58.13%（P<0.01）；畸形率顯著高于正常對(duì)照組，分別為9.84%和2.11%（P<0.01）；（2）雙酚A 灌洗組的受精率為43.28%，顯著低于正常組78.13%（P<0.01），囊胚形成率為26.14%，略低于正常對(duì)照組30.11%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 雙酚A可致小鼠精子質(zhì)量明顯下降，受精和胚胎發(fā)育能力降低，是影響小鼠生育能力的重要的精源性因素。

[關(guān)鍵詞] 雙酚A；體外受精；胚胎發(fā)育；畸形率

[中圖分類號(hào)] R321.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）09-28-02

雙酚A（bisphenol A，BPA）化學(xué)名4-二羥基二苯基丙烷（C15H16O2），是苯酚和丙酮的重要衍生物，廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、牙科填充劑、嬰兒用瓶等塑料行業(yè)，是人們?cè)谏a(chǎn)生活中不可避免接觸到的一類環(huán)境雌激素，BPA可以各種環(huán)境介質(zhì)為載體，通過呼吸、食物鏈等途徑進(jìn)入機(jī)體[1-2]，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響生精過程中正常的細(xì)胞凋亡過程，造成細(xì)胞過早、過多的凋亡，嚴(yán)重時(shí)引起成熟精子數(shù)目減少，精子畸形率增加[3]，甚至不育。Martinez等[4]早已經(jīng)證實(shí)，BPA對(duì)大鼠和小鼠的發(fā)育毒性作用，對(duì)大鼠精子生成的影響亦有報(bào)道[5]，但對(duì)其對(duì)小鼠體外受精和胚胎發(fā)育的精源性系統(tǒng)研究未見報(bào)道，本研究擬對(duì)雙酚A小鼠動(dòng)物模型精子的發(fā)育情況、體外受精能力及胚胎發(fā)育進(jìn)行系列跟蹤研究，以探討精源性雙酚A對(duì)小鼠生育能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精子的采集 將BPA胃灌洗組和對(duì)照組頸推脫臼處死，剪取雙側(cè)附睪采用我們的專利產(chǎn)品“睪丸精子剝離器（專利號(hào)200920017966.0）”處理附睪和睪丸組織，獲得精子，G-GAMETE培養(yǎng)液中上游30 min，收集后部分用于精子的質(zhì)量分析，部分用于IVF授精。

1.2.2 卵母細(xì)胞的采集 將26只8～10周齡雌性昆明小白鼠，于精子采集的前3 d中午12：00時(shí)腹腔注射PSMG 10 IU/只，48 h后，注射HCG100 IU/只，（PSMG、HCG均購(gòu)自寧波生物技術(shù)公司，批號(hào)分別為：091006，090221）于注射HCG后的l8 h頸椎脫臼處死，取出輸卵管，置于洗卵液中，用1 mL注射器針頭在解剖鏡下刺破輸卵管膨大部位，沖出卵冠丘復(fù)合物，清洗后移入G-GAMETE培養(yǎng)液中，37.0℃，6% CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2.3 體外授精 取卵后2 h，加入上游后的精子，37.0℃，6% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，3 h后進(jìn)行受精觀察，以第二極體出現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)記錄受精后1.5 d、2.5 d、3.5 d、4.5 d、5.5 d、6.5 d的胚胎發(fā)育情況，以6.5 d的囊胚形成率為最終囊胚形成率。

1.2.4 精子質(zhì)量分析及胚胎觀察 精子活力分析采用SCA全自動(dòng)精液分析儀進(jìn)行，形態(tài)學(xué)染色采用巴氏法，至少計(jì)數(shù)200條精子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

3 討論

雙酚A對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用已經(jīng)被證實(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過雙酚A處理的小鼠的精子活力明顯低于對(duì)照組；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組精子畸形率明顯高于對(duì)照組，正常情況下小鼠頭部長(zhǎng)度10～20 μm，頸部長(zhǎng)度10～20 μm，尾部長(zhǎng)度在200～300 μm[6]，雙酚A處理后，小鼠的頭部、頸部及尾部明顯變化。說明經(jīng)過雙酚A處理后影響到了雄性生殖系統(tǒng)，并有可能影響到精子的形成過程。精子的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，一個(gè)精原細(xì)胞產(chǎn)生4個(gè)精子，且精子的發(fā)生過程自性成熟起無時(shí)不刻都在進(jìn)行。雙酚A可通過不同的途徑來影響精子的發(fā)生過程。精子畸形率升高，在一定意義上說明雙酚A有一定的毒性和致畸作用。除此之外，BPA可導(dǎo)致多種生物生殖功能下降、生殖器腫瘤、免疫力降低，還可擾亂機(jī)體正常內(nèi)分泌功能[7-9]。

在體外，胚胎的發(fā)育需要有正常的精子和成熟的卵子結(jié)合后，在培養(yǎng)基環(huán)境中，經(jīng)過序貫培養(yǎng)，逐漸由受精卵發(fā)育到囊胚的.雙酚A處理后的精子，質(zhì)量發(fā)生改變，在很大程度上會(huì)影響胚胎的發(fā)育潛能[10]。研究數(shù)據(jù)表明，畸形率越高，胚胎的發(fā)育潛能逾受到限制，囊胚的形成率也會(huì)相應(yīng)下降。同時(shí)，有實(shí)驗(yàn)表明，雙酚A處理的小鼠，其血清中的NO水平顯著升高，NO的增加可引起脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞死亡[3，11]，這可能是胚胎發(fā)育潛能被限制的一個(gè)原因。經(jīng)過雙酚A處理的小鼠，其精子畸形率顯著增加，導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能差，囊胚形成率降低。這說明，雙酚A對(duì)精子產(chǎn)生的影響，會(huì)在形成配子后，早期的胚胎發(fā)育中發(fā)揮持續(xù)性的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的比較，認(rèn)為雙酚A對(duì)雄性生殖細(xì)胞有明顯的致畸作用，并最終影響胚胎的早期發(fā)育。雙酚A影響胚胎發(fā)育的具體機(jī)制還不清楚，但總的來說，這種影響是會(huì)持續(xù)存在的，而且，NO升高而引起的脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞毒性可能伴隨胚胎的整個(gè)發(fā)育過程。其具體的作用機(jī)制和途徑有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-02-18）