PADI4基因與白血病細胞分化關系的實驗研究

李紅江??潘素飛??史露露??宋冠華??姜國勝

[摘要] 目的 體外探討PADI4基因與白血病細胞分化的關系。 方法 檢測HL60、K562、U937等9株不同白血病細胞株中PADI4在mRNA水平的表達情況，建立ATRA誘導HL60細胞分化模型，然后分別利用RT-PCR及WB技術檢測PADI4基因在轉錄和翻譯水平的表達變化。 結果 不同類型的白血病細胞株中PADI4表達情況不同。ATRA誘導HL60細胞后，在藥物作用的96 h內，隨著藥物作用時間的增加，在轉錄和翻譯水平PADI4表達水平逐漸下調，與對照組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。 結論 PADI4與白血病細胞的分化有關，ATRA誘導HL60細胞分化后PADI4表達下調。

[關鍵詞] 白血病；肽酰基精氨酸脫亞胺酶-4；HL-60細胞；細胞分化

[中圖分類號] R733.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）08-28-03

PADI4（peptidylarginine deiminase 4）即肽酰基精氨酸脫亞胺酶-4，最早發現于人類白血病細胞HL60細胞中[1]。該酶在Ca2+存在的情況下可將多肽鏈中的精氨酸殘基催化成瓜氨酸殘基，此過程稱之為瓜氨酸化。瓜氨酸化的蛋白往往改變其大分子構象，從而導致其生化活性發生改變[2]。已有研究表明在各種惡性腫瘤以及惡性腫瘤患者的血清中PADI4均高表達，但在正常及良性腫瘤中PADI4不表達或者表達很低，這說明PADI4與惡性腫瘤的發生、發展有關[3]。但是目前還沒有PADI4與白血病細胞分化有關的研究報道，在信號通路以及其生理狀態下的作用機制研究亦尚不明確。

1 材料與方法

1.1 一般資料

人急性早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞及K562、U937細胞本實驗室保存；Thp1、Raji、Jurkat、6T-CEM、Hut78和NB4等6株白血病細胞株購于中科院上海生命科學院細胞庫，RPMI Medium 1640為Invitrogen產品，ATRA購于Sigma公司，以95%乙醇配制成1×10-6 M儲存液，-20℃避光保存。

1.2 HL-60、K562、U937等9株白血病細胞株的培養及檢測

HL60、K562、U937、Raji、6T-CEM、Jurkat、THP-1和NB4等8株白血病細胞株采用1640+10%胎牛血清，Hut78細胞采用IMDM+10%胎牛血清，其他培養條件均為：培養液中含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、300 mg/L L-谷氨酰胺，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規培養，收集狀態良好的細胞，RT-PCR檢測PADI4在翻譯水平的表達情況。

1.3 HL-60細胞分化模型的建立

HL-60細胞在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、300 mg/L，L-谷氨酰胺的1640培養液常規傳代培養。取對數生長期細胞調整細胞密度為1×106/mL，加入1μM ATRA作用0、24、48、72、96 h后收集細胞，備用。以狀態良好，常規隔兩天半量換液傳代培養，以未加藥的細胞作為對照組。收集作用0、96 h細胞，常規操作，分別利用流式以及RT-PCR檢測HL60細胞表面標志分子CD11b變化。

1.4 RT-PCR檢測ATRA誘導的HL-60細胞分化模型中PADI4轉錄水平表達變化

收集0、24、48、72和96 h細胞，1500 r/min離心5 min，去上清，3 mL PBS洗滌3次，Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的濃度及純度。用M-MLV（TaKaRa公司）逆轉錄cDNA，然后PCR擴增。擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000為DNA marker，β-actin基因為內參照，GELDos1000凝膠成像分析儀分析掃描各條帶，測定各目的基因表達量。引物序列如下：β-actin基因（540bp）F：GTGGGGCGCCCCAGGCACCA；R：CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC；PADI4基因（533bp）F：CCGTGTGACCCCAGAGCAGCCC；R：GTGCTCAGGGTCAGCGACA。

1.5 統計學處理

每組實驗重復3次，采用SPSS10.0統計軟件進行單因素方差分析、方差齊性檢驗以及4個實驗組與對照組的兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HL60、K562等9株白血病細胞株中PADI4轉錄水平表達情況

常規Trizol法提取細胞總RNA，然后做RNA定量，RT-PCR檢測PADI4表達情況，以β-actin基因為內參。結果見圖1。由結果可知，不同白血病細胞中PADI4轉錄水平的表達情況不同，其中HL60、Raji表達最高，K562、U937其次，這就說明PADI4或許與白血病細胞的分化有關系。

2.2 ATRA對HL60細胞分化的影響

常規操作，流式檢測ATRA作用0 h和96 h的HL60細胞表面CD11b分子表達變化。結果見圖2。由流式檢測結果可知，ATRA作用96 h后，CD11b分子表達明顯上調，說明ATRA誘導HL60細胞分化模型建立成功。

2.3 ATRA誘導HL60分化后PADI4表達變化

常規收集、檢測ATRA分別作用0、24、48、72、96 h的細胞，通過目的條帶與內參條帶的灰度值的比值，實驗獨立重復做3次，3次的數據見表1。由統計分析結果可知，單因素方差分析實驗組與對照組相比，具有統計學意義（P<0.01）；組與組之間多重比較P值也均小于0.01，故可得出結論1μM的ATRA誘導HL60細胞24 h后至誘導作用的96 h內，隨著作用時間的延長，PADI4在轉錄水平逐漸降低，和對照組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。說明PADI4與白血病細胞的分化有關系，低水平表達的PADI4可誘導HL60細胞的分化。

3 討論

近年來，白血病細胞的靶向殺傷治療成為白血病治療的發展趨勢，在臨床上有著良好的應用前景，已成為白血病可能治愈的手段，靶向基因的研究成為研究熱點。

本研究通過檢測9株不同類型的白血病細胞發現，在這9株細胞中PADI4均有表達，以此可以推測PADI4基因是白血病篩查的潛在靶點。研究表明PADI4主要表達在血液淋巴細胞，并且在炎癥和免疫反應中發揮作用。因為由HL60細胞誘導的粒細胞和巨噬細胞中檢測到了PADI4的表達，所以認為PADI4和這些細胞的分化、凋亡有關[4-7]。我們通過建立ATRA誘導HL60細胞分化模型檢測也證明了隨著HL60細胞分化程度的提高，PADI4表達逐漸下調。但是在生理狀態下，PADI4的準確功能和作用底物還知之甚少。

到目前為止，對PADI4的調控機制還不明確。本研究通過建立ATRA誘導HL-60細胞的分化檢測PADI4表達變化，在此基礎上進而后續研究探索其可能的信號通路。Dong等[8]發現雌二醇可以通過經典和非經典途徑調控PADI4的表達。在經典途徑中，雌二醇和雌二醇受體結合形成復合體，然后經由啟動子上的雌二醇反應元件調控PADI4表達。在非經典途徑中，雌二醇-雌二醇受體復合物作用在AP-1、NF-Y和SP-1等轉錄因子上，而這些轉錄因子可以結合在PADI4的啟動子上特異性的調控PADI4的表達。另一方面，Cuthbert等發現PADI4通過對這些基因的pS2-啟動子上的H3組蛋白的瓜氨酸作用對抗H3組蛋白的甲基化作用從而抑制了雌二醇受體基因的表達。或許是通過PADI4的瓜氨酸化作用，雌二醇得以以負反饋的方式調控雌二醇敏感基因。近來，Tanikawa等[9]報道PADI4的第一個內含子區域有P53的結合位點，進而P53可以活化PADI4。進而他們發現敲除PADI4可以衰減P53介導的增長抑制活性，這表明PADI4介導的蛋白質的瓜氨酸化在P53信號通過路中發揮作用。Yao等[10]和Li等[11]運用染色體免疫共沉淀技術（chip）研究了P53靶基因的啟動子，發現PADI4的過表達通過催化精氨酸殘基為瓜氨酸殘基抑制了精氨酸甲基化轉移酶對H3組蛋白的甲基化作用。結果，P53靶基因表達下調，導致細胞凋亡過程和細胞周期的紊亂。Liu等[12]通過誘導體外培養的人類白血病細胞HL-60細胞和人類急性T淋巴白血病細胞Jurkat細胞的PADI4的過表達發現PADI4可以誘導P53、P21和Bax基因的表達上調，導致細胞周期停滯和線粒體介導的細胞凋亡。

迄今為止，很多生物標志分子已用于腫瘤診斷。但是對于腫瘤預后的大規模調查來說，這些生物標志的特異性和敏感性還不夠，因為這些腫瘤標志僅僅在一種或幾種腫瘤有表達。PADI4在各種惡性腫瘤中都高表達，但是在正常組織和良性腫瘤中不表達或表達很低。我們可以考慮用PADI4酶作為一種免疫組化標記，從而區分腫瘤細胞和非腫瘤細胞，并且可以定義腫瘤的結構。因為可以檢測到惡性腫瘤患者的血液中PADI4表達水平很高，但是手術切除腫瘤以后，患者血液中的PADI4表達水平明顯降低，因此可以將該酶作為腫瘤預后的一種血清標志以彌補目前腫瘤診斷的方法的不足。此外，PADI4在腫瘤細胞表達的特殊性使得PADI4可以作為腫瘤治療的潛在靶點。因此PADI4具有重要的臨床應用價值。

目前，對于PADI4與白血病細胞分化的關系的研究甚少，本研究結果表明，不同類型的白血病細胞中PADI4均有表達，不同細胞表達情況不同，并且HL60細胞經過ATRA誘導分化后PADI4表達明顯下調，說明PADI4基因與白血病細胞的分化有關，這為以后PADI4基因調控的研究以及體內試驗研究提供的理論基礎，為白血病的靶向治療提供了新的潛在治療靶點。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-03-22）