乳腺癌生物標志物CK19、HER2和血清CEA、CA153聯合檢測的臨床意義

孫昕??李嘉嘉??王道斌

[摘要] 目的 探討血清和生物腫瘤標志物CEA、CA153、CK19、HER2檢測在乳腺癌診斷中的臨床價值。 方法 選取不同臨床分期乳腺癌患者145例，乳腺疾病60例，正常對照50例。應用蛋白芯片法、流式細胞術和熒光原位雜交技術測定其水平和陽性表達率。結果 CEA、CA153水平在不同臨床床分期乳腺癌各組中差異均具有統計學意義（P<0.05），在HER2表達為陽性的不同臨床分期各組中差異均具有統計學意義（P<0.01）；CEA、CA153、CK19陽性表達率在不同臨床床分期乳腺癌各組中差異均具有統計學意義（P<0.05），而在HER2表達為陽性的平在不同臨床床分期乳腺癌各組中，Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組分別與Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌組相比較，顯示出差異具有統計學意義（P<0.01），但Ⅲ期與Ⅳ期之間比較則差異無統計學意義（P>0.05）。結論 CEA、CA153、CK19為乳腺癌重要的腫瘤標志物，測定其水平和陽性表達率可作為臨床病情和療效監測的輔助手段。

[關鍵詞]乳腺癌；腫瘤標志物；CK19；HER2；聯合檢測

[中圖分類號] R725 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）08-37-04

生物腫瘤標志物表皮生長因子受體（HER2）和上皮源性細胞特異性角蛋白19（CK19）表達乳腺癌的鑒別診斷和臨床療效起著較為重要的作用。而血清腫瘤標志物CEA和CA153則更是臨床上廣泛應用的標志物，且具有取樣簡便、無創傷、可持續觀察等優點。我們通過熒光原位雜交法（FISH）和先進的流式細胞術（FCM）以及多腫瘤標志物蛋白芯片法對145例不同期別的乳腺癌患者及60例乳腺良性腫瘤患者血清中的腫瘤標志物CEA、CA15-3含量和HER2及CK19陽性表達率進行檢測，并與50例正常人群進行對照，探討它們在乳腺癌的診斷、治療及預后判斷中的臨床意義，現將實驗結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有病歷均來源于安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科2008年1月～2009年12月收治的乳腺癌患者，每例均經手術證實，病理資料完整，年齡26～70歲，平均（47.52±17.11）歲。所選病例Ⅰ期患者20例；Ⅱ、Ⅲ期患者各40例；Ⅳ期45例，而Ⅳ期患者中淋巴結轉移10例；肝、肺轉移各5例；骨轉移10例；腦轉移5例；多臟器轉移10例。而良性乳腺腫瘤患者60例，其中乳腺纖維腺瘤25例；漿細胞性乳腺炎15例；乳腺腺病10例；乳腺潴留囊腫5例；乳腺囊性增生病5例；年齡22～68歲，平均（51.25±16.23）歲。所有受試對象排除妊娠、感染、肝腎功能不全、代謝性疾病和心腦血管疾病等并發癥。另外選取本院健康體檢中心健康體檢者50例，年齡20～70歲，平均（42.17±19.89）歲。

1.2 樣本的制備

取受試對象清晨空腹靜脈血4.0 mL，分別置EDTA抗凝管2.0 mL、普通管2.0 mL，前者用于CK19檢測（應在4 h內完成檢測）；后者靜置后分離出清亮血清，置潔凈試管中，置-70℃低溫保存。供CEA、CA153檢測。良、惡性腫瘤患者均于手術前取樣，而需進行治療的患者均于治療前取樣。健康對照組于體檢時取樣，血清待測樣品嚴禁溶血；抗凝血則嚴禁血凝塊。同時收集經外科手術受試對象乳腺癌蠟塊作為HER2檢測標本。

1.3 檢測和判定方法

1.3.1 采用多腫瘤標志物蛋白芯片診斷試劑盒（湖州數康生物科技有限公司提供）測定受試對象血清中的CEA、CA153的含量；以超出正常值上限為陽性（CEA<0.5?g/L、CA153<35 U/mL）

1.3.2 應用流式細胞術方法（美國Beckman Coulte EPICS-XL Ⅱ型流式細胞儀）測定CK19陽性表達率。抗凝外周血100?L，加入10?L CD45 PE-CY5，混均避光，25℃孵育10 min，加入打孔試劑100?L REG A，混均，避光反應10 min，離心棄上清液，沉淀加入100?L REG B避光反應5 min后，加入20?L CK19-FITC/ISO-FITC避光反應15 min，離心，加入1 mL PBS重新懸浮細胞，上機檢測。設置CK19本對照和陰性對照，流式細胞術檢測每管標本1×106～3×106細胞。激發波長λ=488 nm。陽性判斷：CD45perCP標記陰性、CK19陽性者定為陽性（CK19+/CD45ˉ），如圖1。

1.3.3 應用熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測HER2基因擴增。HER2（FISH試劑盒選購北京金茗嘉生物技術有限公司，美國VYSIS公司進口分裝）檢測方法嚴格按照試劑盒附件說明書，按步驟進行實驗。結果分析：計數30個細胞統計Ratio值（Ratio值=30個細胞核中紅信號總數/30個細胞核中綠信號部數）。Ratio<1.8為陰性結果，提示：樣本無HER2基因擴增；Ratio>2.2為陽性結果，提示：樣本中HER2基因發生擴增。當Ratio值在1.8～2.2之間時，可選擇增加計數細胞至100個或采取重做FISH實驗來判斷最終結果，如圖2。

采用SPSS15.0統計軟件進行統計學分析。CK19和HER2結果選用配對計數資料x2檢驗（Me Nemar檢驗）和Kappa檢驗分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

由表1可見，不同分期的乳腺癌各組CEA、CA153水平及CEA、CA153、CK19陽性表達率極顯著高于乳腺疾病組和正常對照組（P<0.01），乳腺疾病組與正常對照組之間差異無顯著性（P>0.05）；在不同臨床分期乳腺癌之間CEA、CA153水平及CEA、CA153、CK19陽性表達率，Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組分別與Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌組比較、Ⅲ期乳腺癌組與Ⅳ期乳腺癌組比較均差異具有顯著性（P<0.05）；而HER2陽性表達率在不同臨床分期乳腺癌各組之間比較差異均無顯著性（P>0.05）。

由表2可見，HER2表達均為陽性的不同臨床分期的乳腺癌各組之間，CEA、CA153水平差異均具有顯著性（P<0.01）；而CEA、CA153、CK19的陽性表達率Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組與Ⅲ期乳腺癌組、Ⅳ期乳腺癌組比較差異均具有顯著性（P<0.01）；但是，Ⅲ期乳腺癌組與Ⅳ期乳腺癌組比較，其CEA、CA153、CK19陽性表達率則差異無顯著性（P>0.05）。

實驗結果計算得到[1]CEA、CA153、Ck19敏感度分別為30.31%、50.75%、44.62%。而選擇3項聯合進行檢測，按文獻[1]判定，對Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌的診斷敏感度可提高到84.60%，而同時也可達到較高的93.43%檢測特異度，與文獻較一致[2]。

3 討論

腫瘤標志物是由腫瘤組織或細胞產生的某些生物化學物質并存在于腫瘤組織中。這此生化物質分泌至血液或其他體液中，其含量可代表腫瘤細胞的存在。因此檢測腫瘤標志物是早期診斷、治療腫瘤的重要手段之一[3]。

CA153被認為是一種較好的乳腺癌血清標志物[4]，并在乳腺癌中過度表達，與臨床分期、腫瘤負荷大小、腋窩淋巴結狀況及雌性受體相關[5]，而廣泛應用于臨床的診斷和治療活動中。但對早期的乳腺癌陽性表達率較低[6]。我們的實驗結果也顯示在Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌受試者中，其陽性表達率也只有18.33%，與文獻[6]相一致。因此CA153單獨應用具有一定的局限性。尤其是因為對早期乳腺癌診斷敏感度較低而不能滿足臨床診療要求[7]。

CEA是胚胎性抗原，胎兒和成人消化道均產生。正常細胞分泌CEA進入胃腸道，而失去極性的癌細胞分泌的CEA則進入血液和淋巴，導致腫瘤患者血清中CEA異常性增高有文獻研究表明，乳腺癌患者中CEA水平與腫瘤的分和進展呈正相關關系[8]。我們的實驗結果也得到相同的結論。

CK19在乳腺癌發生早期即有陽性表達。尤其在乳腺癌中高表達，同時其陽性表達率與腫瘤的負荷、轉移和臨床療效密切相關[9]。因此它是乳腺癌微轉移中研究、應用最多的生物標志物之一[10]。CK19檢測多采用PT-PCR方法，但該方法假陽性率高、易污染、特異度較低且費時費力成本高等缺點，而該法陽性檢出率也只有36%左右[11]，在臨床應用上受限。我們采用先進的流式細胞術（FCM）檢測外周血CK19陽性表達率，不僅顯示出其客觀準確性，同時還可進行細胞計數并對細胞進行診斷。其敏感度達1～5×10-5。另外標本為單細胞懸液，取樣簡便，極大地適用于臨床[12-13]。

HER2基因過表達不僅與腫瘤的發生、發展有關，而且是評估臨床預后的重要指標[14]。我們實驗顯示其總的陽性表達率為33.10（48/145），在不同臨床分期限各組乳腺癌患者比較差異均無顯著性（P>0.05）。但檢測HER2基因有無擴增對乳腺癌患者后期治療、指導臨床在化療藥物選擇及判斷療效十分重要[14]。本實驗結果提示：CEA、CA153、CK19對觀察乳腺癌患者病情進展、判斷療效可能具有一定的臨床意義。另外也提示在臨床工作中應聯合應用多指標檢測，可以彌補單指標的缺陷和不足，提高診斷正確率，避免漏診、誤診的發生。如本實驗單指標的敏感度為30.31%～50.75%，而三項指標聯合檢測敏感度可提高到84.60%。

[參考文獻]

[1] 符本琪，劉獻華，佘煒，等.多腫瘤蛋白芯片檢測系統臨床應用評價[J].實用醫院臨床雜志，2006，3（2）：34-35.

[2] Pavicevic R，Bubanovic G，Franjevic A，et al.CYFRA 21-1 in non-small cell lung cancer-standardisation and application during diagnosis[J].Coll Antropol，2008，32（2）：485-498.

[3] 李健，劉雄英，陳瑞娥.聯合檢測血清CA153、CA125、CA19-9在乳腺癌早期診斷中的價值[J].實用醫技雜志，2008，15（13）：1696-1698.

[4] Massidda B，Ionta MT，Foddi MR.Usefulness of pyridinium crosslinks and CA153 as markers in metastatic bone brest carcionoma[J].Anticancer Res，1996，16（4）：2221-2223.

[5] 雷鈞，邵江華.Cyclin D與惡性腫瘤關系的研究進展[J].實用臨床醫學，2007，8（11）：127-129.

[6] 承曉定，施海文.血清CA153、CEA聯檢對乳腺癌的診斷價值[J].交通醫學，2008，22（6）：631-633.

[7] 張武，高琦，張玲，等.多項腫瘤標志物對腫瘤敏感性實測統計[J].放射免疫學雜志，2001，14（6）：355-356.

[8] 羅光輝，曲士杰，方機.聯合檢測血清腫瘤四項對惡性腫瘤早期診斷及動態檢測的意義[J].廣東醫學，2004，25（6）：703-704.

[9] 鄧君，楊洋.細胞角蛋白19基因表達及其腫瘤標志物在乳腺癌診斷中的應用[J].國外醫學（臨床生物化學與檢驗學分冊），26（7）：390-392.

[10] Pimpec-Barthes FL，Danel C，Lacave R，et al. Association of CK19 mRNA detection of occult cancer cell in mediastinal lymph nodes in no-small cell lung carcinoma and high risk of early recurrence[J].Eur J Cancer，2005，41（2）：306-311.

（下轉第頁）

（上接第頁）

[11] Stathopulou A，Vlachonikolis I，Mavroudis D，et al.Molecular detection of eytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer： evaluation of their prognostic significance[J].J Clin Onco，2002，20：3404-3412.

[12] Lin JC，Chen KY，Wang WY，et al. Evaluation of cytokeration mRNA as a tumor marker in the peripheral blood of nasopharynged carcinoma patients receiving concurrent chemoradiotherapy[J].Int J Cancer，2002，97：548-553.

[13] Maguire D，OSullivan GC，MCNamara B，et al.Bone marrow micromet-astases in patients with brian metastases epithelid cell tumors[J].QJM，2000，93（9）：611-615.

[14] 王曉蘭，姚凡，劉楠，等.FISHd乳腺癌組織HER2/neu原癌基因檢測上的應用及其臨床意義的研究[J].中國醫科大學學報，2008，37（5）：664-666.

（收稿日期：2013-03-18）