中空海藻酸鈣固定化白色鏈霉菌轉化去氫表雄酮的研究

公亮亮??張露露??張松??劉新利

[摘要] 目的 利用生物轉化方法來生產具有抗氧化和抗腫瘤活性藥物羥基化去氫表雄酮。方法 利用中空海藻酸鈣膠囊對白色鏈霉菌進行固定化，然后用此固定化菌對甾體類藥物去氫表雄酮（DHEA）進行生物轉化，并對固定化菌的轉化條件進行優化，以期獲得高產量的羥基化DHEA。結果 中空海藻酸鈣膠囊制備的固定化白色鏈霉菌對DHEA具有轉化作用，并且可以通過固定化白色鏈霉菌的二次轉化來實現羥基化DHEA產率的提高，我們同時獲得了固定化白色鏈霉菌的最優轉化條件：對生長兩天的白色鏈霉菌進行固定化，溫度35℃，pH值7.0，轉速150 r/min，轉化時間3 d。結論 采用固定化白色鏈霉菌轉化DHEA方法可行，而且此種方法具有廣泛的工業應用價值。

[關鍵詞] 中空海藻酸鈣膠囊；白色鏈霉菌；固定化

[中圖分類號] Q93 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）08-65-04

甾體類藥物去氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是一種C19腎上腺甾體類藥物，主要具有抗癌、延緩衰老及免疫調節等作用[1]。以其為中間體能合成更多有重要生理活性的甾體類藥物，如抗氧化活性及抗腫瘤作用更顯著的藥物羥基化DHEA[2]。但是利用化學合成法合成羥基化DHEA成本太高，而且會產生很多副產物。因此，利用生物法對DHEA進行轉化以獲得藥物羥基化DHEA可以有效的節約成本[3]，尤其是可進行連續發酵的固定化細胞的生物轉化越來越受到人們的青睞[4]。在微生物的固定化過程中，非常有效的一種固定化材料是中空海藻酸鈣膠囊。中空海藻酸鈣膠囊是起源于海藻酸鈣凝膠珠的一種固定化體系，是一種有廣闊發展前景的新型微膠囊體系[5]。本研究以中空海藻酸鈣膠囊為載體，實現了對白色鏈霉菌的有效固定化，而且獲得的固定化細胞可用來生物轉化DHEA生成藥物羥基化DHEA，并對固定化白色鏈霉菌轉化DHEA的條件進行了優化，以提高產物的轉化率。

1 實驗材料

1.1 菌種

白色鏈霉菌，由山東省微生物工程重點實驗室菌種保藏中心保藏。

1.2 培養基

斜面培養基PDA（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，pH自然；轉化培養基PDB（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然。

1.3 材料和試劑

去氫表雄酮（武漢合中生化制造有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市廣成試劑有限公司）；氯仿（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；顯色劑：10%硫酸-乙醇溶液；CaCl2（分析純，天津市風船化學試劑有限公司）；海藻酸鈉（化學純，天津市大茂化學試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（化學純，天津環宇紅星食品貿易有限公司）。

1.4 實驗儀器

DHZ-DA型全溫搖床（江蘇太倉市實驗設備廠）；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；SW-CJ-IB超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ZF-2型三相紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；90-2型定時恒溫磁力攪拌器（上海天平儀器廠）；J232D-Epson perfection V330 Photo 掃描儀（上海家佳樂計算機網絡有限公司）。

2 實驗方法

2.1 中空海藻酸鈣膠囊的預制備與優化

將羧甲基纖維素鈉加入到蒸餾水中加熱煮沸使其溶解，然后向此溶液中加入CaCl2，將此混合液攪拌均勻作為陽離子溶液。將海藻酸鈉（SA）加入到含蒸餾水的三角瓶中，加熱煮沸使其完全溶解，自然降溫待用。將上述制備好的陽離子溶液用注射器逐滴加入到SA溶液中，攪拌5～10 min，過濾獲得膠囊。將獲得的膠囊用無菌水洗凈，然后再放入到1%（m/v，g/100 mL）的CaCl2溶液中繼續攪拌約20 min左右，進一步固定化微膠囊的外表面。然后，再次用蒸餾水清洗以除去膠囊表面的Ca2+，最后將膠囊浸于4℃的蒸餾水中備用[6]。通過單因素實驗，對SA濃度、CMC濃度、CaCl2濃度、滴加速度、攪拌時間、針頭孔徑、滴加高度和搖床培養時間等進行優化，確定膠囊制備的最佳條件，以獲得膠囊最佳的形狀和機械強度。

2.2 中空海藻酸鈣固定化白色鏈霉菌轉化DHEA的驗證

膠囊的制備過程如實驗方法2.1。固定化白色鏈霉菌時，只要將培養兩天的白色鏈霉菌與CaCl2/CMC陽離子溶液混和均勻，然后用此溶液滴制微膠囊即可。固定化好的白色鏈霉菌添加到含有60 mL的液體PDA培養基中，再加入600μL的1 mg/mL的丙酮溶解的DHEA，然后放入到搖床上生物轉化3 d。轉化結束后，對發酵液進行乙酸乙酯萃取、旋轉蒸發濃縮、TLC點板，分別在三用紫外儀（波長：253.7 nm）和顯色（顯色劑：硫酸：乙醇=1∶9）條件下驗證白色鏈霉菌經過固定化之后對DHEA是否有轉化活性。本實驗分別以自由菌和雜菌對DHEA的轉化作為陽性和陰性對照，做兩組平行對照。

2.3 固定化白色鏈霉菌轉化DHEA條件優化

主要是考察溫度、pH、轉速、轉化時間、固定化菌的生長狀態對固定化白色鏈霉菌轉化DHEA的影響。實驗過程利用單因素實驗，設置不同的影響因素梯度，考察各個因素對固定化白色鏈霉菌轉化DHEA的影響，產物7α和7β-OH-DHEA通過薄層掃描儀（TLCS）來定性定量分析[7]。

2.4 固定化白色鏈霉菌的重復利用

固定化白色鏈霉菌一次轉化完成后，對發酵液進行分離，然后將固定化菌用無菌水多次洗滌，清洗完的蒸餾水跟分離得到的發酵液一起進行萃取，濃縮，TLC點板和轉化率的確定。清洗完成后再將固定化菌加入到含有600μL DHEA（1 mg/mL）和60 mL PDA液體培養基的250 mL三角瓶中進行二次轉化，轉化3 d。以同樣的方法進行3次轉化。轉化完成后測定各次轉化對DHEA的轉化率。

3 結果與分析

3.1 中空海藻酸鈣膠囊的制備與優化

實驗通過將CMC和CaCl2組成的陽離子溶液向SA溶液中滴加，成功完成了中空海藻酸鈣膠囊的制備，獲得的中空海藻酸鈣膠囊如圖1。

球形的膠囊有利于保持膠囊的均勻，從而有助于營養物質的均勻擴散和產物的有效排出。而一定機械強度的膠囊可以防止膠囊在搖床上培養菌時破裂，菌體外泄。通過單因素實驗獲得最佳的膠囊制備條件：SA濃度1%（w/v，1g/100 mL，下同）、CMC濃度1%、CaCl2濃度8%、滴加速度210滴/min、攪拌時間20 min、滴加高度8 cm、大孔徑的針頭。在此最優條件下膠囊的成球能力很好，直徑：（10.0±1.2）mm， 內徑：（8.2±0.9）mm，厚度：（0.9±0.13）mm，機械強度：（11.50±1.8）N。

3.2 中空海藻酸鈣固定化白色鏈霉菌轉化DHEA

采用3.1中制備膠囊的最佳條件，完成了對白色鏈霉菌菌體的固定化如圖2[8]。由結果可知，充滿白色鏈霉菌菌體的膠囊呈現黃色，不透明，這與空的中空海藻酸鈣膠囊對比明顯。將上述固定化膠囊加入含有60 mL液體PDA培養基的250 mL三角瓶中，再加入DHEA進行生物轉化，分別在三用紫外儀和顯色條件下獲得的轉化結果如圖3。固定化白色鏈霉菌對DHEA具有轉化作用，雖然相對于自由菌其轉化率偏低，但是固定化白色鏈霉菌對DHEA表現出了明顯的轉化。因此通過白色鏈霉菌固定化的方法來實現DHEA的生物轉化是可行的，并且可以通過條件優化和固定化菌的重復利用來實現轉化率的提高[9]。

3.3 固定化白色鏈霉菌轉化DHEA條件優化

利用單因素實驗測定了溫度、pH、轉速、轉化時間、固定化的自由菌的生長狀態對固定化白色鏈霉菌轉化DHEA的影響結果如圖4。各因素對固定化白色鏈霉菌轉化DHEA的結果影響很大。通過對各因素優化之后，固定化白色鏈霉菌對DHEA的轉化率達到40%左右，使得其轉化率有一個明顯的提高。實驗過程獲得的最優轉化條件為：對生長兩天的白色鏈霉菌進行固定化，溫度為35℃，pH為7，轉速為150 r/min，轉化時間為3 d。

3.4 固定化白色鏈霉菌的重復利用

將固定化好的白色鏈霉菌分別進行一次、二次和三次轉化，以實現固定化白色鏈霉菌的重復利用，從而達到羥基化DHEA的高產率。不同的轉化次數對DHEA的轉化率見圖5。固定化白色鏈霉菌對DHEA的第一次轉化轉化率為37%，二次轉化率為50%，三次轉化率為13%。固定化菌的二次轉化能力較強，三次轉化能力較弱。造成這種結果的原因可能是剛固定化好的白色鏈霉菌在膠囊內經過一個延遲過程，再加上第一次分離時，產物可能在膠囊內不能充分釋放，導致一次獲得的轉化率低于二次轉化獲得的轉化率。而菌體的老化以及膠囊表面附著的培養基等造成膠囊部分堵塞可能是導致三次轉化率降低的原因[10]。

圖5 固定化白色鏈霉菌的重復利用

4 討論

近年來，甾體類藥物的應用領域不斷擴大，尤其是其在醫藥工業中的廣泛應用，使其成為市場化程度較高的醫藥產品之一，而且甾體類藥物已經是僅次于抗生素的第2大類藥物[11]。在這些甾體類藥物中，DHEA是很重要的一員，它可以來源豐富、價格低廉的薯蕷皂苷元為原料，經簡單的化學合成法而得。此外，以其為中間體獲得的羥基化DHEA可以提高肌體免疫力，具有明顯的免疫調節能力，對B淋巴細胞也有顯著的抑制作用。它們還可以延緩衰老，保持青春活力，增強體能，改善情緒和睡眠，提高記憶力等，因此是一種具有較大發展前景的藥物[12]。利用中空海藻酸鈣膠囊固定化細胞對DHEA進行生物轉化來獲得藥物羥基化DHEA能有效的提高目標產物的轉化率，并且可以實現固定化菌的重復利用，可以更好的對產物進行分離，同時還能大量的節約成本，是一種非常有潛力的生物轉化方法。

本研究中，利用中空海藻酸鈣膠囊對DHEA的轉化菌株白色鏈霉菌實現了較好的固定化，并且證實固定化白色鏈霉菌對DHEA仍保留轉化活性。而且，經過單因素實驗的優化實現了固定化白色鏈霉菌對DHEA轉化率的提高，使得固定化菌的轉化率從原來的30%左右提升到41%。此外，本研究還實現了固定化菌的重復利用，固定化菌的二次轉化比一次轉化轉化率提高了13%，說明了固定化菌的重復利用情況較好。固定化菌的重復利用不僅提高了固定化白色鏈霉菌的轉化率，同時節省了孢子懸液的制備和固定化等過程，有效的節約了成本以及固定化菌對DHEA的轉化周期。綜上所述，本研究采用中空海藻酸鈣膠囊固定化白色鏈霉菌轉化DHEA是一種非常經濟適用的生物轉化方法，同時也為羥基化DHEA的工業生產提供了理論基礎。

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（收稿日期：2013-03-15）