京棗試管苗染色體穩定性觀察

權燕敏　肖海峰　陳宗禮

摘要：以繼代培養20代后經生根培養基生根的京棗試管苗為試驗材料，用常規染色體壓片和顯微觀察相結合的方法對根尖進行染色體數目觀察，結果顯示，京棗試管苗的染色體數目2n=24條的占85%，說明經繼代培養的京棗試管苗仍保持遺傳穩定性。

關鍵詞：棗；試管苗；染色體；核型

中圖分類號：S665.1：Q343.2+4 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）08-0036-03

植物組織培養技術已廣泛應用于珍貴種質資源的離體保存、優良體細胞無性系變異材料的創建以及物種庫的建立和保存，因而研究組培試管苗能否穩定遺傳具有很大的應用價值。目前，國內外關于山葡萄_[1]、芥藍_[2]、百合等_[3～6]品種組培苗遺傳穩定性的報道有許多，但關于棗樹組培苗遺傳穩定性的研究較少_[7～10]。本試驗旨在通過探討京棗組培苗的遺傳穩定性，為棗樹組培苗的快繁、生產和推廣提供理論依據與指導。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

供試材料為京棗（Zizyphus jujuba Mill. Jingzao）試管苗，由陜西省延安大學紅棗繁育工程重點實驗室提供，取繼代培養20代后經生根培養基生根的京棗試管苗根尖用于染色體觀察。

用于染色體制片的主要試劑有飽和對二氯苯溶液、改良苯酚品紅染液、0.075 mol/L氯化鉀溶液。

1.2培養基和培養條件

試管棗苗生根培養基（S15）：1/2 MS+1.0 mg/L IBA +0.02 mg/L NAA +20%蔗糖+0.55%瓊脂。

培養條件：溫度為24～27℃，相對濕度為60%～65%，光照強度為1 500～2 000 lx。

1.3材料準備與取樣

根據試管苗的長度，將繼代培養的京棗試管苗剪成2～4 cm的莖段，轉接到S15生根培養基，接種后第3天統計生根的試管苗數，以后每隔5天統計生根數。

取樣：取剛長出1.5～2.0 cm長的根，此時根分生能力最旺盛，最適合于染色體觀察。取樣時間：上午9時。

1.4材料處理

（1）預處理：將所取材料浸入飽和對二氯苯溶液，振蕩培養箱常溫振蕩4 h。

（2）固定：預處理后，用蒸餾水將材料清洗3次，每次3～5 min，再用現配的Carnoys固定液（無水酒精∶冰醋酸=3∶1）常溫下固定12 h。

（3）前低滲：固定后的材料用蒸餾水清洗3次，每次3～5 min，然后用濾紙將材料上的水分吸干，放入0.075 mol/L KCl溶液中30 min，15 min換液一次。

（4）解離：將材料置于1 mol/L HCl中60℃恒溫水浴加熱，根尖解離時間不宜過長，一般為10 min，解離充分的標志是組織間有大量氣泡，解離后的材料用鑷子夾出迅速放入1 mol/L冷鹽酸中浸泡30 s。

（5）后低滲：經冷鹽酸浸泡后，蒸餾水清洗3次，每次3～5 min，放入0.075 mol/L KCl溶液中60 min，30 min換一次溶液。

（6）染色：用改良苯酚品紅染液染色24 h。

（7）壓片：選取材料分生最旺盛的部分（一般為未展開葉片的葉原基、莖尖的分生組織），用解剖針取肉眼剛好能看清的一小塊組織，放在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片（中間不能有氣泡）。

（8）脫水：將染色壓制好的制片，倒放在盛有45%醋酸+95%酒精（V∶V=1∶1）的培養皿中，使載玻片稍傾斜（一邊墊上一玻棒），經5～10 min，可見蓋玻片從載玻片上脫離，用吸水紙吸去載玻片和蓋玻片邊上多余的酸液，再依次經過以下濃度梯度的酒精：20%、30%、50%、70%、85%、95%、100%，每個濃度停留30 min。

（9）透明：經過以下步驟：1/3二甲苯﹢2/3純酒精 →1/2二甲苯﹢1/2純酒精→2/3二甲苯+1/3純酒精→純二甲苯，逐步進行，每步3 min，使材料既除去酒精，又不收縮變形。

（10）封藏：將玻片從二甲苯中取出，在標本上滴光學樹膠（樹膠的量以蓋上蓋玻片后剛好鋪滿為合適），然后蓋上一同處理的蓋玻片（中間沒有氣泡）。將封好的玻片標本在恒溫培養箱中40℃烘烤至干燥，貼上標簽，即可永久保存。

（11）鏡檢：40×10倍光學顯微鏡觀察約60個比較清晰的分裂相細胞，鑒定其中的染色體數目，進行OLYMPUS顯微照相。

2結果與分析

對60個根尖細胞進行染色體計數分析，從表1可以看出，京棗根尖染色體數目2n=24的占85%，百分數檢驗差異極顯著，說明京棗繼代培養20代的組培苗染色體數目未發生變化，即表現穩定遺傳。染色體圖見圖1。

3討論

3.1染色體制片方法的探討

3.1.1解離時間和溫度的把握 棗樹細胞的細胞壁比較厚，解離時間不能太短，時間太短，會使解離不徹底，染色效果不好，甚至染不上色；但也不能太長，否則酸會水解染色體中的蛋白質，使染色體受損，難以得出正確的實驗結果。因此，在解離時，要注意隨時觀察組織的解離狀況，有大量氣泡即說明解離充分，一般為10 min。解離溫度要控制在60℃，溫度過高會使酸解離速度加快，導致解離的進程不能被很好的控制。因此，本試驗采用兩支溫度計，一支測解離直管內的實際溫度，一支測定管外水溫，從而準確控制解離溫度。

3.1.2低滲時間酸濃度的高低對染色體的皺縮程度有一定影響，過高會使染色體高度皺縮，從而影響染色體觀察。低滲可以通過離子互換降低組織間的酸濃度，使染色體膨脹，在壓片后保持清晰的形態，以利于觀察，如果低滲時間過短，會使染色體皺縮，難以觀察。根據本試驗的結果，棗樹染色體的低滲時間以1 h 為宜。

3.2結果探討本試驗試管棗苗染色體出現24、48、23、22、21、19等多種數目。有關染色體變異的原因，多數學者認為與核內有絲分裂、核融合、核內復制、多極有絲分裂及染色體斷裂等現象有關，是培養基中多種激素作用引起組培材料細胞分裂異常所致_[11]。類似的組培過程中染色體數目變異的情況還發生在金絲小棗、黑麥草、甜瓜、四合木、百合等植物中_[10]。也有人認為染色體變異與材料來源、成苗途徑及培養時間等因素有關_[6]。由于本試驗對所有材料都是平行處理，推測出現的少數染色體數目變化除細胞分裂異常原因外，還可能是在制片過程中沒有將細胞充分壓開，導致有的染色體粘在一起或相互重疊而看不清楚，也有可能是在壓片時用力過猛使染色體溢出細胞外。

本課題通過染色體制片和顯微鏡觀察相結合的方法對京棗試管苗的核型進行了初步研究，試驗結果證明該品種試管苗經繼代培養基培養后仍能夠穩定遺傳，這為棗樹組培快繁的應用、優良品種選育以及組織培養育種等提供一定的理論參考，同時也為進一步的染色體研究奠定了基礎。

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