基質金屬蛋白酶—7的基因克隆和原核表達

劉繼科等

摘 要：研究構建人基質金屬蛋白酶7（MMP-7）的原核表達載體，并進行原核表達獲得重組蛋白MMP-7。以人腎腫瘤組織總RNA為模板，PCR方法獲得MMP-7成熟蛋白的基因序列，構建含10xhis標簽的原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3），并經異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導表達，獲得重組蛋白，并經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），檢測其表達情況。最終得到pET24a（+）-MMP-7-10his重組質粒，誘導表達后重組蛋白占總蛋白的41%左右，獲得21.2kD大小蛋白，與目的蛋白大小一致，純度大于90%，為進一步研究奠定基礎。

關鍵詞：基質金屬蛋白酶-7；基因克隆；原核表達

中圖分類號 Q55 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）07-31-04

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類依賴Zn2+的參與ECM降解的蛋白水解酶，可降解基底膜和細胞外基質（extracellar matrix， ECM）的大多數蛋白質，并參與調節ECM動態平衡，是維持ECM穩態最重要的一類酶，其與機體許多病理過程密切相關[1-2]。在血管形成、炎癥、風濕活動、胚胎發生、纖維化及腫瘤侵襲轉移等生物體內的生理及病理過程中的研究顯示，這些生理及病理過程中伴隨有MMPs的表達量上升[3-7]。

自1962年，Gross和Lapiere在蝌蚪尾巴組織發現間質膠原酶（即MMP-1）[8]，其后陸續發現的MMPs被依次按發現時間順序命名，至今至少已發現人源MMP23種，包括膠原酶、明膠酶、基質降解素、膜型MMPs和其他共五大類。其中基質金屬蛋白酶7（MMP-7）屬基質溶解素（Matrilysin），與腫瘤發生、細胞凋亡和血管形成等病理過程聯系密切[9]，是近年來的研究熱點。本研究利用基因工程技術，通過基因克隆，構建基質金屬蛋白酶7成熟蛋白原核表達載體，并進行原核表達以獲得高純度重組蛋白，可以為進一步研究MMP及各種機體的病理相關性提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 載體pET24a（+），菌株E.coli DH5a和BL21（DE3）均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 人腎腫瘤組織總RNA購自Biochain，內切酶Nde I、BamH I、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶以及T載體pMD18-T simple購自TaKaRa公司，反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒購自羅氏，引物合成和測序由英駿生物技術有限公司提供，其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 MMP-7基因克隆 根據GeneBank中MMP-7成熟蛋白的基因編碼序列信息，采用軟件Primer Premier5設計引物S1/A1（引物序列見表1）。以人腎腫瘤組織總RNA為模板，按羅氏的反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒說明進行反轉錄實驗，合成cDNA，并以其為模板擴增目的基因。

RT-PCR程序為：65℃，10min、55℃，30min、85℃，5min。

PCR程序為：94℃預變性5min；以94℃，30s、52℃，30s、72℃，1min為循環條件，30個循環；72℃，10min。

1%凝膠電泳鑒定條帶大小，應為519bp，PCR鑒定為陽性的話，純化回收PCR產物，連接到pMD18-T simple載體中得到pMD-MMP-7質粒，轉化到E.coli DH5a克隆菌株中，提取轉化質粒，PCR鑒定，結果為陽性后送測序。

1.2.2 pET24a（+）-MMP-7-10his原核表達載體的構建 設計引物A2/A3和引物S2（引物序列見表1），上游引物S2的5端攜帶Nde I酶切位點，下游引物A3的5端引物攜帶BamH I酶切位點，和編碼10xhis標簽和兩個終止密碼子的序列。以pMD-MMP-7質粒為模板，S2/A2為引物進行PCR應得到551bp片段，再將其純化后作為模板，以S2/A3為引物進行PCR應得到578bp片段。1%凝膠電泳鑒定條帶大小，應為578bp，PCR鑒定為陽性的話，純化回收PCR產物，連接到pMD18-T simple載體中，轉化到E.coli DH5a克隆菌株中，提取轉化質粒，PCR鑒定，結果為陽性后送測序。

PCR程序分別為：94℃預變性5min；以94℃，30s、55℃，30s、72℃，1min為循環條件，30個循環；72℃，10min。

94℃預變性5min；以94℃，30s、60℃，30s、72℃，1min為循環條件，30個循環；72℃，10min。

用Nde I和BamH I分別酶切MMP-7的578bp目的片段和pET24a（+）表達載體，產物凝膠純化回收，用T4連接酶做連接反應，得到pET24a（+）-MMP-7-10his原核表達載體，將其轉化E.coli DH5a菌株，提取轉化質粒，PCR鑒定，結果為陽性后送測序。原核表達載體pET24a（+）-MMP-7-10his的構建如圖1所示。

1.2.3 pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3）重組表達菌的構建及鑒定 將測序結果正確的陽性重組質粒pET24a（+）-MMP-7-10his轉化E.coli BL21（DE3）感受態，得到重組表達菌pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3），將轉化的重組表達菌株pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3）涂固體培養平板（卡那抗性），37℃培養過夜，挑5個單克隆，分別接種到5mL TB液體培養基（卡那抗性），37℃，250rpm/min條件下培養6h，使菌液OD600=0.6～0.8，加入IPTG誘導劑至終濃度為0.4mmol/L誘導，37℃，200rpm/min條件下培養4h，4℃，6 000rpm/min離心5min，收集菌體，菌體加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，15%SDS-PAGE檢測各菌株表達情況。

1.2.4 MMP-7蛋白誘導表達、可溶性分析 活化高表達菌株，按1：50轉接到10mL TB液體培養基中（卡那抗性），搖床培養2h，加入IPTG至終濃度0.4mmol/L，在37℃條件下，250rpm/min培養4h，誘導目的蛋白的表達。取1mL表達菌液，12 000rpm，5min離心，收集菌體，PBS洗滌兩次后，1mL PBS重懸，做冰浴超聲3min（200W，超聲5s，間歇5s），破碎細胞，澄清液于4℃、12 000rpm/min離心5min，SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀。

2 結果與分析

2.1 MMP-7基因克隆與重組表達載體構建 以人腎總RNA為模板反轉錄后，PCR獲得目的基因片段，此研究中分別以S1/A1、S2/A2和S2/A3為引物經多次PCR，最終得到的PCR產物片段為578bp，與預測大小一致，包含測序正確的MMP-7基因序列，以及設計的10xhis標簽序列，經雙酶切后連接構建正確的重組表達載體pET24a（+）-MMP-7-10his，PCR及測序結果顯示其構建正確（圖1、2）。

測序結果如圖4，其中下劃線序列為酶切位點序列，粗體部分為10xHis序列及雙終止子，方框內為載體序列，其余序列是MMP7序列，與目標序列完全重合。

2.2 重組表達菌的構建及鑒定 表達菌株的表達量可能存在差異，所以在表達時，選取高表達菌株有利于后面的表達。陽性克隆轉化BL21（DE3）后涂卡那抗性抗性平板篩選，挑5個克隆與液體抗性培養基誘導表達，并經15%SDS-PAGE檢測各菌株重組蛋白表達顯示，結果顯示，各菌株在預期蛋白大小帶處均有表達，且其菌株表達量大致相當（圖5）。

2.3 MMP-7蛋白誘導表達、可溶性分析 菌株經液體抗性培養基誘導表達，取菌液離心，收集菌體，破碎細胞，澄清液離心后，SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀以鑒定MMP-7蛋白表達和得到可溶性分析結果。結果顯示誘導表達后重組蛋白占總蛋白的41%左右，獲得21.2kD大小蛋白，與目的蛋白大小一致，純度大于90%，為進一步研究奠定基礎（圖6）。

3 討論

基質金屬蛋白酶廣泛參與機體的生理病理過程，尤其是關于基質金屬蛋白酶與各類腫瘤發生及演變的關系的研究顯示，在腫瘤發生演變過程中，往往伴隨基質金屬蛋白酶的過量表達并參與腫瘤侵襲轉移等演變進程。而基質金屬蛋白酶抑制劑的研究顯示其具有抗腫瘤、治療心血管疾病、治療炎癥等生物活性。其中在抗腫瘤領域，相對于細胞毒試劑治療等傳統方法，以基質金屬蛋白酶為藥物靶點，選擇其拮抗藥物成為新型的理想抗腫瘤方法。原核表達系統具有操作簡單、表達量高、成本低等優點，構建重組蛋白原核表達載體，利用原核表達系統表達，可快速獲得較大量的重組蛋白。本研究采用原核表達系統，同時為了更有利于后期的純化，通過引物設計，在表達載體中設計加入10xhis序列和雙終止子序列，10xhis序列的加入使得重組蛋白帶有高親和標簽，有利于蛋白純化，且標簽分子量小，對蛋白結構功能影響小，而加入的雙終止子序列則保證在加入標簽時MMP-7重組蛋白更接近原始大小，利于后期的研究，最終經高表達的原核表達后，獲得了高蛋白表達量和高純度的重組人MMP-7蛋白。但原核表達也存在表達蛋白易以包涵體形式存在的缺點，本研究表達的MMP-7重組蛋白即為包涵體，筆者嘗試多次復性，均不是很理想，有待于進一步的研究。本研究有利于MMP-7和各種機體病理相關性的進一步研究，而MMP及其抑制劑的研究也日趨熱門，相信隨著相關研究的不斷深入，人們將在腫瘤生物學和腫瘤治療等一些方面做出更大的成就。

參考文獻

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（責編：徐世紅）