紫花苜蓿的組織培養與快繁技術研究

李云玲　苗錦山

摘 要：以紫花苜蓿為材料，研究了不同外植體和不同激素處理對苜蓿愈傷和胚狀體分化的影響。結果表明，子葉和下胚軸作外植體，在MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L +BA 0.5mg/L培養基上愈傷組織誘導率較高，下胚軸的誘導率要高于子葉；下胚軸在MS+BA 3.0mg/L培養基中胚狀體分化率最高。

關鍵詞：紫花苜蓿；組織培養；快繁技術

中圖分類號 Q943.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）07-51-02

目前，土壤鹽漬化是影響生態環境和農業生產的嚴重問題。在鹽脅迫下，植物代謝會受抑制，生長變得緩慢，嚴重時，葉子萎蔫，甚至死亡。目前，全世界的鹽漬化土地約占陸地面積約30%，而在中國，鹽漬地的比例明顯高于世界平均水平，天津東部濱海平原區土壤鹽漬化尤其嚴重。另外，日光溫室的大面積普及使土壤鹽漬化的問題也越來越明顯[1]。

紫花苜蓿，豆科苜蓿屬，是一種比較抗鹽的作物[2]，其分布遍及五大洲，苜蓿中蛋白質含量可達80%，營養價值豐富，而且再生性強，是改良土壤的良好綠肥[2-3]，因而被稱為“牧草之王”。如果能在鹽堿地上種植苜蓿，既可以起到綠化作用，又可創造經濟價值，還可以改良土壤，兼顧社會效益、經濟效益和生態效益[4]。由于苜蓿是多年生異花授粉植物，自交結實率低，僅通過常規育種進行品種改良非常困難，而以植物遺傳轉化技術改良苜蓿品質是一條有效途徑[5]。筆者通過研究不同外植體及不同培養基激素改變對愈傷組織形成和芽分化的影響，以期建立紫花苜蓿的快繁再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試苜蓿品種為紫花苜蓿，由濰坊科技學院蔬菜工程技術研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的培養 將紫花苜蓿的種子流水充分洗凈后，浸泡10h左右，然后放入超凈工作臺中。先用75%的酒精浸泡30s，然后用無菌水沖洗3次，取出后用0.1%的升汞消毒10min，再用無菌水沖洗3～5次，洗去多余的升汞。接種到MS培養基中，7～10d后種子陸續萌發、子葉展開。

1.2.2 不同激素對不同外植體愈傷誘導的比較試驗 以無菌苗的子葉、下胚軸和葉片為外植體，在MS基本培養基的基礎上，分別附加不同濃度的生長素2，4-D、NAA和細胞分裂素6-BA、3%蔗糖、10mg/L的硝酸銀、0.2%的木炭粉。每種培養基處理6瓶，每瓶接種10個外植體。培養20d后進行數據統計。

1.2.3 愈傷組織的繼代培養 將生長較好的愈傷組織轉入繼代培養基中繼續培養，繼代培養15d后進行分化實驗。

1.2.4 不同激素對愈傷組織分化的比較試驗 將愈傷組織階段生長了15d左右的愈傷組織，轉入分化培養基中進行培養。在MS基本培養基的基礎上，分別附加不同濃度的生長素NAA、細胞分裂素6-BA、KT、3%蔗糖和0.2%的木炭粉。每種培養基處理6瓶，每瓶接種5塊愈傷組織，培養25d后進行數據統計。

2 結果與分析

2.1 不同外植體對誘導紫花苜蓿愈傷組織的影響 由表1可知，在M1～M4 4種培養基中，下胚軸的愈傷組織誘導率均在90%以上，子葉的誘導率也較高，在75%以上，兩者在M1培養基中的愈傷誘導率均可達到100%，而在M5中，兩者誘導率都比較低。葉片在5種培養基中的愈傷誘導率都很低。

從形成的愈傷組織形態來看，下胚軸和子葉形成的愈傷組織質地密實，顏色為綠色，表面有細小突起，后期分化能力較強；而葉片形成的愈傷組織，顏色為黃白色，水浸樣，松軟粘連，難以繼代，后期分化能力很差。將子葉和下胚軸生成的愈傷組織轉入繼代培養基中培養，培養基為M1，15d后觀察，愈傷組織體積增大，利于進行分化培養。

2.2 不同激素處理對苜蓿愈傷組織形成的影響 由表1可知，無論是子葉還是下胚軸，隨生長素2，4-D和NAA濃度的增加，愈傷形成率也越來越高。這表明生長素對于愈傷的形成作用明顯，是愈傷組織形成的主要因素。細胞分裂素6-BA的濃度也影響愈傷組織的誘導率，隨6-BA濃度的升高，愈傷組織誘導率也會越高。2，4-D，NAA和6-BA在本次試驗的濃度范圍內，愈傷組織誘導率均隨彼此濃度的增加而增加。

2.3 不同激素對苜蓿胚狀體分化的影響 將誘導出的下胚軸愈傷組織進行繼代培養，15d后轉移到表2中所列4種培養基中進行培養，結果如表2。可以看出，細胞分裂素對苜蓿分化率有著較重要的作用。隨6-BA濃度的增加，胚狀體的分化率也越高；可選用添加了BA2.0～3.0mg/L的MS培養基進行胚狀體誘導。在培養基中同時加入生長素時，分化率反而下降。分化成功的胚狀體經過約25d后，可以在培養基上生成小苗。

3 討論與小結

實驗發現，在愈傷組織及胚狀體分化的培養基中加入硝酸銀及木炭粉，接種的外植體褐變程度會減輕，并且有助于形成的愈傷組織結構致密，顏色發綠，有突起，容易形成胚狀體。這一結果與朱海軍等[6]、杜何為等[7]的研究是一致的。

從實驗結果可以看出，不同類型的外植體會對愈傷組織的誘導產生影響。子葉和下胚軸均可作為外植體再生，但是下胚軸相比子葉而言，其具有更短的愈傷組織誘導時間、更高的誘導率和胚狀體分化率，這與其他研究者得到的結論相一致[8-9]，因此在下一步實驗中可以把下胚軸作為紫花苜蓿組織培養首選的外植體。

參考文獻

[1]盛學斌.大渤海區海水入侵態勢與防治構想[J].生態學報，1996，16（4）：418-426.

[2]武之新，翟玉柱，楊連臺，等.濱海鹽漬土壤苜蓿保苗技術的研究[J].草業科學，1994，11（6）：61-63.

[3]劉文輝.隴東紫花苜蓿的經濟性狀及其發展前景的研究[J].草業科學，1992，9（3）：7l-72.

[4]田瑞娟，劉艷軍，楊靜慧，等.不同激素不同外植體對苜蓿品種再生的影響[J].南方農業，2007，3（1）：13-14.

[5]馬海燕，張博，郝興明，等. 苜蓿高效再生體系研究進展[J].草業科學，2005，22（11）：30-33.

[6]朱海軍，俞紅強，義鳴放. 藍刺頭組織培養和葉片再生植株的研究[J].核農學報，2007，21（6）：581-584.

[7]杜何為，許先鳳，黃敏，等. 硝酸銀對玉米幼胚組織培養的影響[J].河北農業科學，2008，12（8）：62-63.

[8]危曉薇，蔡麗娟，李仁敬.紫花苜蓿組織培養及其再生植株[J].新疆農業科學，1999（2）：73-75.

[9]舒文華，耿華珠，閻倫興.紫花苜蓿胚軸愈傷組織培養與植株再生[J].草業科學，1993，10（3）：65-67.

（責編：徐世紅）