再生絲素蛋白及構象轉變離子效應的核磁研究

馬振

摘 要： 通過NMR測試技術研究了再生桑蠶絲素蛋白在水溶液中的分子結構及在有鎂離子效應時的構象轉變情況。研究表明NMR顯示，再生絲素蛋白的構象主要為無規線團，而加入離子后主要為β折疊構型。Mg 離子通過與絲素蛋白的羰基和氨基間的鍵合作用誘導絲素蛋白向更規則的β折疊轉化。

關鍵詞： 絲素蛋白 NMR 離子效應 構象轉變

從元素上看，絲素蛋白除含C，H，O，N外，還含有K，Cu，Mg等多種元素，這些無機金屬離子在生命體系中發揮著不可或缺的作用。研究表明這些金屬離子在成絲過程中能促進絲纖維的形成[1]。通過拉曼和固體核磁等方法證實K和Cu等離子對絲素蛋白構象轉變的影響[1，2]。

NMR在分子及宏觀水平上提供了豐富的方法來研究生物大分子結構和功能[3]。Asakura[4]等用核磁共振實驗證明了再生絲素和腺體中的絲素蛋白溶液具有類似的構象。這里我們報道了再生絲素蛋白氘代溶液的 C NMR核磁譜。相對固態NMR有較高分辨率和窄的線寬[5]，通過參考對Nephila edulis拖絲NMR的指認對桑蠶絲素蛋白碳譜進行了指認，同時基于對再生絲素蛋白的指認，通過用 CNMR考察了Mg 離子的加入對絲素蛋白構象轉變的影響。

1.實驗部分

1.1絲素蛋白粉的制備

絲素脫膠：將市購的桑蠶繭去蛹并剝成片狀、剪成約1cm 的碎片后，放入保持沸騰狀態，質量比為0.5%的Na CO 水溶液中進行脫膠處理，蠶繭與水溶液的質量比為1∶100。半小時后，將已成絲狀的蠶繭撈出并擰干。重復上述操作一次后，用去離子水將脫膠好的蠶絲清洗至無滑膩感并吹干。50℃烘干，得脫膠絲素。目的：脫去蠶繭中得絲膠蛋白及一些雜質。

絲素溶解：50%的氯化鈣溶液加熱至沸，將干燥的脫膠絲素加入（w/v=1：25～50），攪拌，使絲素充分溶解、冷卻、過濾，濾液裝入透析袋（截留分子量為8000～12000）中，放入裝有10倍于絲素溶液體積的去離子水中透析，每4h左右換一次水，3天后透析結束。這樣就得到了濃度很低的絲素溶液。將裝有絲素溶液的透析袋放于室溫下蒸發（最好用風扇吹），使大多數水分蒸發，得到濃度較高的絲素溶液。經準確測量得到的絲素溶液濃度為0.07g/mL，這種溶液作為儲存溶液，其他濃度的溶液由這一溶液稀釋得到。在樣品制備中，要避免強烈攪拌和震蕩，以防引起構象的變化。將制得的較高濃度的絲素溶液冷凍干燥即可得絲素粉。

1.2離子效應的固體樣品制備

取5mL原絲素蛋白溶液再取1.68mL 7×10 mol/L的MgCl 的溶液，混合反應1h后冷凍干燥（因為絲素蛋白在高溫干燥時會變性，室溫下干燥影響水溶性而難以做NMR測試，所以采用冷凍干燥），得干燥的固體樣品。

1.3核磁共振測定

本文的NMR譜圖是在瑞士Brucker公司出廠的400MHz超導核磁共振波譜儀（AVANCE AV 400MHz Digital FT-NMR Spectrometer）上獲得的。本實驗以氘代水做溶劑，化學位移參照外標TMS方法。

2.結果與討論

2.1再生桑蠶絲素蛋白中氨基酸的指認

天然同位素豐度的再生桑蠶絲素蛋白 CNMR譜如圖1所示。譜圖顯示了從蛋白質側鏈和骨架引起的共振。由于沒有同核J偶合，譜峰很窄，因此能對各不同氨基酸引起的自旋共振進行指認。天然同位素豐度的絲素蛋白 CNMR譜的指認可以通過用全 C標注特定氨基酸的液態絲素做單脈沖實驗而得到。如標注丙氨酸時，用 C的丙氨酸喂食蜘蛛，其產生的 C標注了的丙氨酸嵌段絲素蛋白的 CNMR通過對照自然豐度的蛋白質 CNMR譜，共振強度明顯增高的峰就是屬于 C標注了的丙氨酸嵌段。

圖1 再生桑蠶（Bombyx mori）絲素蛋白質子去偶 CNMR譜圖

2.2加Mg 離子的核磁譜圖分析

再生桑蠶絲素蛋白的各主要氨基酸嵌段的C 和C 化學位移基本都落在β折疊的二級結構區間，加入Mg 后，絲素蛋白各項氨基酸的 C發生了位移，化學位移普遍向高場移動，具體表現如下：丙胺酸，甘氨酸，絲氨酸C 及酪氨酸的C 都由原來的無規線團變化為β折疊的區間范圍內；亮氨酸的C 在離子作用前后變化不大，但也向高場移動，落入β折疊的區間。丙胺酸的C 由原來的β折疊區間移動到α螺旋結構范圍，絲氨酸的C 在α螺旋范圍內（實驗數據和文獻有一定的偏差，我們大致可以根據接近哪個范圍來判斷）。從總體看，Mg 處理的絲素蛋白C 有從無規線團向β折疊轉化的趨勢，因此可以認為，加入Mg 離子后，絲素蛋白構象由SilkⅠ結構向SilkⅡ結構轉化，如圖2所示。

圖2 Mg 離子處理過的再生桑蠶（Bombyx mori）絲素蛋白質子去偶 CNMR譜圖

3.結論

通過對再生桑蠶絲素蛋白在水溶液中的 CNMR核磁譜的分析，以及加入Mg 離子的 CNMR核磁譜的分析，得到 C的指認。同時通過對照最常見五種氨基酸嵌段的不同二級結構 CNMR化學位移分布區間可以得知，再生絲素蛋白的構象主要為無規線團，而加入Mg 離子后，構象轉變為β折疊構型。Mg 離子通過與絲素蛋白的羰基和氨基間的螯合作用誘導絲素蛋白向更規則的β折疊轉化。

參考文獻：

[1]楊宇紅，邵正中，陳新.天然蠶絲與絲素蛋白多孔膜的生物降解性研究[J].化學學報，2006，64（22），30-36.

[2]胡炳文，趙學舟，宗小紅，周平.多組分絲素蛋白-Cu（II）配合物的EPR譜解析[J]. 物理化學學報，2006，22（2），167-171.

[3]林江濱，姚晉榮，周麗，陳新，邵正中.再生蠶絲的制備及其結構和性能初探[J].高等學?；瘜W學報，2007，28（6），1181-1185.

[4]Asakura T.，Watanabe Y.，Uchida A..13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk[J].gland - Elsevier Macromolecules，1984，17（5），1075-1081.

[5]Hronska M.，van Beek J. D.，Williamson P. T. F. et al. 13C Solid-State NMR Study of Structural Heterogeneity [J]. Biomacromol.，2004，12（5），834-839.