例析現(xiàn)代生物技術(shù)中的篩選問題

周偉

篩選是現(xiàn)代生物技術(shù)中培育生物新類型過程中常用的手段。研究、解析有關(guān)篩選問題的試題，可以培養(yǎng)同學(xué)們思維的嚴(yán)謹(jǐn)性和創(chuàng)造性?，F(xiàn)將現(xiàn)代生物技術(shù)中的篩選問題加以分類匯總，以供參考。

一、基因工程中的篩選

為了篩選出導(dǎo)人了目的基因的受體細(xì)胞，一般是在培養(yǎng)基中加入可檢測標(biāo)記基因是否表達(dá)的物質(zhì)，再根據(jù)受體細(xì)胞表現(xiàn)出的性狀加以選擇，有時還要考慮目的基因的導(dǎo)人對標(biāo)記基因的影響。常用的標(biāo)記基因有抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。

例1 目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖一所示：

（1）構(gòu)建人工質(zhì)粒時要有抗性基因，以便于_______________。

（2）pBR322分子中有單個的BarnH Ⅰ限制酶作用位點(diǎn)，現(xiàn)將經(jīng)BarnH Ⅰ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復(fù)_______________鍵，成功地獲得了重組質(zhì)粒。說明_______________。

（3）為了檢測上述重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無amp^R和tet^R的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上。使絨布面沾上茵落，然后再將該絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果（空圈表示與圖二對照無菌落的位置）。與圖三空圈相對應(yīng)的圖二中的茵落表現(xiàn)型是_______________，圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是_______________。

解析 （1）質(zhì)粒上的抗性基因可作標(biāo)記基因，便于鑒定受體細(xì)胞中是否導(dǎo)人目的基因。

（2）DNA連接酶能連接磷酸二酯鍵。經(jīng)BamH Ⅰ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因能連接起來，說明這兩種酶切割獲得的黏性末端相同。

（3）進(jìn)行導(dǎo)入操作時，普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒都可能導(dǎo)入受體細(xì)胞，而目的基因自連的環(huán)狀物無法導(dǎo)入。在導(dǎo)入操作后存在三種受體細(xì)胞的混合物：多數(shù)沒有導(dǎo)人任何質(zhì)粒的受體細(xì)胞（普通受體細(xì)胞）、很少導(dǎo)入pBR322質(zhì)粒的受體細(xì)胞（不含目的基因）和導(dǎo)人重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞（獲得目的基因）。圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，將滅菌絨布按到圖二中培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到圖三含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，仍能生長的也能抗四環(huán)素，空圈為不能抗四環(huán)素的（只能抗氨芐青霉素）。圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌既能抗氨芐青霉素，又能抗四環(huán)素，說明導(dǎo)入的是pBR322質(zhì)粒，而不是重組質(zhì)粒（重組質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因被切斷，不能表達(dá)，因此含重組質(zhì)粒的大腸桿菌只抗氨芐青霉素）。

答案 （1）篩選（鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞） （2）磷酸二酯兩種限制酶（BamH Ⅰ和BgtⅡ）切割得到的黏性末端相同 （3）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素pBR322質(zhì)粒

二、植物細(xì)胞工程中的篩選

對雜種植物細(xì)胞的篩選，常用方法分析如下：①細(xì)胞系互補(bǔ)選擇法：包括葉綠體缺失互補(bǔ)、營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗性互補(bǔ)等；②物理特異性差異選擇法：利用兩個原生質(zhì)體的物理特異性差異的選擇，包括原生質(zhì)體的大小、顏色、浮密度等的不同進(jìn)行選擇；③生長特異性差別選擇法：根據(jù)兩種原生質(zhì)體親本的生長特異性來選擇。

例2

右圖為細(xì)胞融合的簡略過程（只考慮兩個細(xì)胞的融合），若A、B是基因型分別為rrHH、RRhh兩個煙草品種產(chǎn)生的花粉，且這兩對基因位于非同源染色體上，由于一對隱性純合基因（rr或hh）的作用，在光照度大于800 lx時，都不能生長。

（1）實(shí)驗(yàn)開始時必須用_______________除去不利于原生質(zhì)體融合的物質(zhì)。

（2）實(shí)驗(yàn)中除獲得雜種細(xì)胞外，還有基因型為_______________的融合細(xì)胞。

（3）設(shè)計(jì)一方法（不考慮機(jī)械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細(xì)胞，方法：_______________。

解析 （1）利用酶的專一性，既能有效去除細(xì)胞壁，又不損害原生質(zhì)體；

（2）融合細(xì)胞可以是同種的兩個細(xì)胞融合（基因型為rrHH或RRhh），也可是不同種的兩個細(xì)胞融合（基因型為RrHh）；

（3）基因型為rrHH或RRhh融合細(xì)胞不能在大于800 lx光照下生長，雜種細(xì)胞（RrHh）能在大于800 lx光照下培養(yǎng)，能增殖分化。

答案 （1）纖維素酶和果膠酶 （2）rrHH、RRhh （3）置大于800 lx光照下培養(yǎng)，收集分化的細(xì)胞團(tuán)

三、單克隆抗體制備中的篩選

在單克隆抗體制備過程中有兩次篩選：第一次篩選是B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，形成B淋巴細(xì)胞一B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞一B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞以及未融合的親本細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，從混合細(xì)胞中選出雜交瘤細(xì)胞；第二次篩選是從雜交瘤細(xì)胞中進(jìn)一步選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。第一次篩選通常在HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行，利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選出雜交瘤細(xì)胞。第二次篩選最常用的方法是有限稀釋法，其基本過程為：將處于對數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液充分稀釋后，接種在多孔的培養(yǎng)板中，然后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定。

例3

下圖表示用生物工程制備人抗A抗體的過程。請回答下列問題：

（1）人的紅細(xì)胞膜表面有被稱為凝集原的特異_______________：從免疫學(xué)角度看，這種凝集原是_______________。

（2）圖中細(xì)胞中1是小鼠體內(nèi)注入人A型血紅細(xì)胞后而獲得的_______________細(xì)胞，這種細(xì)胞具有產(chǎn)生_______________的特點(diǎn)，但難以在體外培養(yǎng)。甲培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞2，是從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)獲取的骨髓瘤細(xì)胞，這種細(xì)胞在體外培養(yǎng)時能_______________，但不會產(chǎn)生抗體。

（3）為了能充分發(fā)揮上述兩種細(xì)胞各自的特點(diǎn)，經(jīng)特殊處理，在促細(xì)胞融合因子的作用下，兩種細(xì)胞發(fā)生融合，形成圖中的細(xì)胞3，這種細(xì)胞稱為_______________。把它在乙培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，則能產(chǎn)生大量的細(xì)胞群，這種方法稱為_______________。

（4）過程①的主要目的_______________。通過過程②或③的培養(yǎng)方法能產(chǎn)生大量_______________抗體。

解析 （1）根據(jù)對細(xì)胞膜組成成分分析，膜上具有特異性的物質(zhì)是糖蛋白或蛋白質(zhì)，而紅細(xì)胞表面的凝集原具有細(xì)胞識別功能、位于細(xì)胞膜外表面，因此推測凝集原最可能是一種糖蛋白，這種特異糖蛋白，在免疫學(xué)上稱為抗原。

（2）依據(jù)單克隆抗體制備過程分析，圖中1應(yīng)代表從經(jīng)使用人A型血紅細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)獲得能產(chǎn)生抗A抗體的效應(yīng)B細(xì)胞（或稱免疫B細(xì)胞），由于效應(yīng)B細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，不能分裂。圖中2代表骨髓瘤細(xì)胞，它具有在體外無限增殖的特點(diǎn)。圖中3代表兩類細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞通過增殖產(chǎn)生大量子細(xì)胞群過程稱為克隆。

（3）由于融合得到的不一定是能產(chǎn)生抗A抗體的雜交瘤細(xì)胞，因此細(xì)胞融合后，還要經(jīng)過篩選，將篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，最終可以大量產(chǎn)生抗A抗體。

答案 （1）糖蛋白 抗原 （2）免疫B淋巴 單一的抗A抗體（或單一的特異性抗體）快速大量增殖 （3）雜交瘤細(xì)胞單克隆 （4）篩選出能產(chǎn)生單一抗A抗體的雜交瘤細(xì)胞抗A單克隆

鞏固練習(xí)

1.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是（ ）。

①B淋巴細(xì)胞；②小鼠骨髓瘤細(xì)胞；③B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞；④小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞；⑤雜交瘤細(xì)胞。

A.①②③④ B.①③⑤ C.②④ D.②③

解析單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)融合時，發(fā)生了以下三種情況：未發(fā)生融合的細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞）、自身融合的細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞自身融合、小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合）以及骨髓瘤細(xì)胞與單個淋巴細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞是制備單克隆抗體所必需的，因此，將其篩選出來。本題考查的是雜交瘤細(xì)胞篩選的機(jī)理和方法。

答案 A

2.研究人員想將生長激素基因通過質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，以表達(dá)產(chǎn)生生長激素。已知質(zhì)粒中存在兩個抗性基因：A是抗鏈霉素基因，B是抗氨芐青霉素基因，且目的基因不插入到基因A、B中，而大腸桿菌不帶有任何抗性基因。則篩選獲得“工程菌”的培養(yǎng)基中的抗生素首先應(yīng)該（ ）。

A.僅有鏈霉素

B.僅有抗氨芐青霉素

C.同時含鏈霉素和抗氨芐青霉素

D.無鏈霉素和抗氨芐青霉素

解析 在基因工程中，目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞中，主要根據(jù)載體質(zhì)粒上的標(biāo)記基因確定的。根據(jù)題意，目的基因沒有插入到基因A、B中，說明這兩個標(biāo)記基因沒有被破壞，抗鏈霉素基因和抗氨芐青霉素基因都能表達(dá)，所以應(yīng)該用同時含有鏈霉素和抗氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

答案 C