基于免培養技術的食用菌病害微生物rDNA測序及初步分析

高能 姚強 宮志遠等

作者簡介：高 能（1986-），女，碩士研究生，主要從事食用菌栽培、遺傳育種及食用菌病害研究。

通訊作者，E-mail：sdgzy2656@126com

摘要：采用CTAB結合DNA凝膠回收試劑盒法提取四種主要食用菌病害組織樣品的宏基因組DNA，用16S rDNA和18S rDNA通用引物分別對樣品的基因組DNA進行PCR擴增、連接、轉化并進行單克隆測序。每對引物隨機挑取20個陽性克隆的rDNA序列進行比對，并對病害微生物的親緣關系進行了初步分析，結果表明四種病害樣品中兩種為細菌性病害，兩種為真菌性病害。

關鍵詞：免培養；食用菌病害；rDNA 序列分析

中圖分類號：Q789 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）06-0011-05

食用菌病害研究的傳統檢測方法主要包括分離、純化、顯微觀察、染色技術、生理生化測定等[1]，所需時間長，準確性較低，往往需要結合其他鑒定技術（如PCR等分子技術）來提高其準確性。

自Pace等[2]首次提出環境宏基因組學、Handelsman等[3]提出基因組的定義以來，宏基因組學已作為新的分子生物學方法，成功應用于土壤[4]、海洋[5]環境微生物及消化道等菌群[6，7]的多樣性研究中。宏基因組技術是以樣品中的微生物群體總基因組作為研究對象，利用測序分析等生物信息學方法，基于非培養方式進行微生物群落多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系等的研究。本試驗基于免培養技術直接提取病害樣品的宏基因組DNA，以16S rDNA/18S rDNA為靶基因進行病害微生物鑒定及親緣關系初步分析，為食用菌病害的分子檢測方法研究提供了依據。

1 材料與方法

11 試驗材料

111 材料 樣品1為平菇黃腐病病樣（PG，圖1A），采自濟南平陰縣孔村鎮食用菌基地；樣品2為雙孢菇褐斑病病樣（SBG，圖1B），采自菏澤市定陶縣馬集鄉牛楊村雙孢菇種植基地；樣品3為雞腿菇黑頭病病樣（JTG，圖1C），采自濟南平陰縣孔村鎮食用菌基地；樣品4為金針菇疑似胡桃肉狀菌病病樣（JZG，圖1D），采自濟南遙墻食用菌種植基地。

112 試劑 CTAB、Tris堿、EDTA、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Taq PCR Master Mix、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒等分子試劑，均購自上海生工生物工程有限公司。

113 引物 細菌16S rDNA通用引物[8]：XF： 5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′，XR： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；真菌18S rDNA通用引物[9]：ZF： 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，ZR： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；pUCm-T載體引物：TF： 5′-GTTGTAAAACGCAGGCCAG-3′，TR： 5′-CAGGAAACAGCTATGA-3′。引物合成及基因測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

12 試驗方法

121 總基因組DNA提取 將所采集樣品的病害部位分離備用，采用CTAB結合DNA凝膠回收試劑盒法提取基因組DNA[10]。

122 PCR擴增及純化 分別利用16S rDNA/18S rDNA通用引物對各個樣品總基因組DNA進行PCR擴增，擴增體系按照試劑盒說明。PCR擴增條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，50～55 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸10 min。并將其產物純化，具體步驟參照試劑盒使用說明。

123 連接轉化 參照T-載體PCR產物克隆試劑盒方法，將純化的PCR產物與pUCm-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α。

124 菌落PCR檢測 利用pUCm-T載體的引物，根據單菌落PCR檢測法[11]對從含有Amp的LB平板上挑取的單菌落進行PCR擴增，檢測是否為陽性克隆。反應體系（25 μl）參照Taq PCR Master Mix使用說明。反應條件：96℃預變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。

125 序列分析 每個樣品每對引物隨機挑選20個陽性克隆進行測序。在GenBank中進行Blast序列比對，從基因數據庫中下載病原菌屬中代表種的16S rDNA或18S rDNA序列，利用MEGA 505等軟件對所得序列及其它常見食用菌病原微生物模式種的序列進行初步的親緣關系分析，構建病原菌屬的系統發育樹（N-J樹）。

2 結果與分析

21 宏基因組DNA的提取

由圖2可知，所得病害樣品的宏基因組DNA片段比較完整，條帶清晰，雜質含量較少，表明提取效果好，可以進行后續試驗。

22 單菌落PCR驗證

利用載體引物TF與TR對隨機挑取的單菌落進行PCR擴增，10%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，結果表明，均能夠擴增出與預計大?。?6S rDNA約為510 bp，18S rDNA約為420 bp）相符的單一核苷酸片段（圖3、圖4）。

23 序列分析

樣品1平菇黃腐病的測序結果經比對表明，20條真菌序列均與平菇Pleurotus ostreatus相關；細菌序列中熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens相關序列15條，鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp相關序列5條。比對結果用MEGA 505軟件分析，從構建的N-J樹（圖5）可以看出，seq PG001與熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）的同源性較高，確定該菌群屬于熒光假單胞桿菌。有報道稱熒光假單胞桿菌可引起平菇的黃腐病[12]，鞘氨醇桿菌大量存在于環境中，目前還未有鞘氨醇桿菌能夠引起平菇等食用菌病害的報道。

樣品2雙孢菇褐斑病的序列比對結果表明，細菌序列中假單胞桿菌Pseudomonas sp相關序列12條，鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp相關序列5條，土地桿菌Pedobacter sp相關序列3條。將對比結果構建N-J樹（圖6），結果表明，seqSBG001與假單胞桿菌（Pseudomonas sp）的同源性較高，seqSBG002與鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp）的同源性較高，seqSBG003與土地桿菌（Pedobacter sp）的同源性較高。宋金俤發現雙孢菇褐斑病的病原菌為假單胞桿菌[13]，土地桿菌普遍存在于土壤中，可由栽培覆土帶入，目前還未有鞘氨醇桿菌或土地桿菌引起雙孢菇等食用菌病害的報道。

樣品3雞腿菇黑頭病的序列比對結果表明，所測得的細菌序列均與假單胞桿菌Pseudomonas sp相關；真菌序列中與輪枝菌Lecanicillium sp和雞腿菇Coprinus comatus相關的序列各有10條。構建N-J樹（圖7）進行分析，seqJTG001與輪枝菌（Lecanicillium sp）的同源性較高，同時由于假單胞桿菌可引起食用菌子實體腐爛，表面發粘并且有臭味，而雞腿菇黑頭病的腐爛屬于干腐型，表面呈灰狀，無味，因此，可以初步判斷雞腿菇黑頭病的病原菌為輪枝菌（Lecanicillium sp）。

樣品4金針菇疑似胡桃肉狀菌病的序列比對結果表明，20條真菌序列中與Pezizomycetes sp相關的序列有15條，與金針菇Flammulina velutipes相關的序列有5條；細菌序列中與鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp有關的序列16條，其它不可培養的細菌的序列4條。由圖8的N-J樹分析得出，seqJZG001與Pezizomycetes sp的同源性較高，seqJZG002與金針菇（Flammulina velutipes）的同源性較高，seqJZG003為不可培養的細菌（Uncultured bacterium），seqJZG004與鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp）的同源性較高。Pezizomycetes sp 屬子囊菌門（Ascomycota），盤菌亞門（Pezizomycotina），盤菌綱（Pezizomycetes）。由于病害發生于金針菇發菌期，初期為白色，后逐漸變為褐色，菌絲表面發干，而細菌在生長過程中會產生粘液，因此，初步推測病原菌為Pezizomycetes sp。據黃年來等[14]報道，引起胡桃肉狀菌病的病原菌為胡桃肉狀菌（Diehliomyces microsporus），本研究未能分離出相關序列。

3 討論

熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）和假單胞桿菌（Pseudomonas sp）主要寄生在食用菌的子實體上，起初為小的黃色、褐色斑點，慢慢地發展成大塊，整個菇體都變成黃褐色，最終使食用菌子實體腐爛。金針菇、滑菇、杏鮑菇、平菇及雙孢菇等腐爛病主要是由熒光假單胞桿菌和假單胞桿菌引起的[12～15]，如平菇黃斑病、雙孢菇干腐病的病原都是假單胞桿菌。雞腿菇的黑頭病是一種真菌性的病害，發病率較高，嚴重影響了雞腿菇的生產。金針菇病害也多是真菌性的病害，主要發生在金針菇發菌期，抑制金針菇菌絲生長，使其無法出菇，最終導致減產甚至絕收。關于本試驗得出的輪枝菌（Lecanicillium sp）和Pezizomycetes sp為病原菌的研究仍少有報道。

能夠簡便、快速、準確地檢測食用菌病原菌是控制病害、防止病害快速蔓延的有效方法。相對傳統微生物分離等方法，宏基因組等分子生物學技術為病原菌的快速檢測開辟了新的途徑。利用PCR技術對病原菌進行檢測與診斷有著較高的特異性和靈敏度的要求，引物設計對PCR是至關重要的[16～18]。夏明星等利用熒光PCR技術快速準確地檢測出引起番茄細菌性潰瘍病的密執安棒桿菌密執安亞種[19]；張祥林等利用細菌16S rDNA研究西瓜細菌性果斑病，設計了能夠檢測病原菌的特異性引物[20]；宏基因組的研究也已應用于甘蔗、小麥、棉花、柑桔等病害的研究[21～24]。因此，建立基于免培養技術、快速高效的食用菌病害檢測方法，為進一步的食用菌病害的防治研究奠定了基礎。參 考 文 獻：

[1] 張愛紅， 苗洪芹幾種植物病原細菌的檢測和鑒定技術[J] 河北農業科學， 2008， 12（8）：30-32

[2] Schmidt T M， DeLong E F， Pace N RAnalysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing [J] J Bacteriol， 1991， 173（14）：4371-4378

[3] Handelsman J， Rondon M R， Brady S F， et alMolecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes： a new frontier for natural products [J] Chem Biol， 1998， 5（10）：245-249

[4] Jiae Y， Sangryeol RScreening for novel enzymes from metagenome and SIGEX， as away to improve it [J] Microbial Cell Factories， 2005， 4（1）：8-13

[5] 褚新明南海海洋微生物宏基因組文庫中酯酶基因的篩選與鑒定[D] 合肥： 中國科技大學， 2008

[6] Gill S R， Pop M， DeBoy R T， et alMetagenomic analysis of the human distal gut microbiome [J] Science， 2006， 312（5778）：1355-1359

[7] Yatsunenko T， Rey F E， Manary M J， et al Human gut microbiome viewed across age and geography [J] Nature， 2012， 486：222-227

[8] 金 敏， 黃愛華， 陳照立， 等常見致病真菌通用引物PCR檢測技術研究[J] 環境與健康雜志， 2009， 26 （11）：969-971

[9] 林居純， 曹三杰， 蔣紅霞， 等細菌16S rDNA基因芯片的構建及應用[J] 中國獸醫雜志， 2011， 47（4）：6-8

[10] 楊同文， 馬利華 CTAB結合DNA凝膠回收試劑盒提取食用菌DNA[J] 生物技術，2009， 19（1）：32-34

[11] 陳書霞， 王曉武， 房玉林單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J] 微生物學通報， 2006， 33（3）：52-56

[12] 李德舜， 曹新紅， 蘇 靜， 等平菇黃腐病病原菌分離與鑒定[J]山東大學學報（理學版），2008， 43（1）：4-7

[13] 宋金俤食用菌病蟲害彩色圖譜[M] 南京：江蘇科學技術出版社， 2004

[14] 黃年來， 林志彬， 陳國良， 等中國食藥用菌學[M] 上海：上海科學技術文獻出版社，2010（第1版上篇）

[15] 衣 杰， 劉曉紅， 李云波幾種常見食用菌細菌性病害的診斷及防治（一）——滑菇、金針菇[J] 中國食用菌， 2005， 24（2）：30-31

[16] Coplin D L， Majerczak D R Identification of Pantoea stewartii subsp stewartii by PCR and strain differentiation by PFGE[J] Plant Disease， 2002， 86（3）：304-311

[17] Frederick R D， Ahmad M， Majerczak D R， et alGenetic organization of the Pantoea stewartii subspstewartii hrp gene cluster and sequence analysis of the hrpA， hrpC， hrpN， and wtsE operons[J] Mol Plant-Microbe Interact， 2001， 14（10）：1213-1222

[18] 姬廣海， 魏蘭芳， 張世光 PCR技術在植物病原細菌研究中的應用[J] 微生物學通報， 2002， 29（4）：77-81

[19] 夏明星， 趙文軍， 馬 青， 等 番茄細菌性潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測[J] 植物病理學報， 2006， 36（2）：152-157

[20] 張祥林， 伍永明， 王 翀， 等 西瓜細菌性果斑病菌的16S rDNA序列分析及特異性引物的設計[J] 植物病理學報， 2007， 37（3）： 225-231

[21] 顏梅新， 黃偉華， 黃誠華， 等 PCR技術在甘蔗病害檢測中的應用[J] 廣西農業科學， 2010， 41（12）：1299-1303

[22] 張競宇， 張正光， 王源超， 等 小麥印度腥黑穗病菌的分子檢測[J] 高技術通訊，2004， 14（1）：31-36

[23] 肖 蕊土壤棉花黃萎病菌的分子檢測[D]楊凌：西北農林科技大學， 2011

[24] 胡 浩， 殷幼平， 張利平， 等 柑桔黃龍病的常規PCR及熒光定量PCR檢測[J] 中國農業科學， 2006， 39（12）：2491-2497 山 東 農 業 科 學 2013，45（6）：20～23，33