小立碗蘚Ran基因的克隆與表達分析

葉帥 王鳳德 張一卉等

同等第一作者：葉 帥（1981-），男，碩士研究生，研究方向為植物分子遺傳學；王鳳德（1979-），男，副研究員，研究方向為植物分子生物學。

摘要：Ran是一種大量分布于細胞核內的小分子的GTP酶，在核質運輸過程中具有十分重要的作用，參與調控細胞分裂及其信號傳導。本研究利用基于同源序列的PCR技術，從小立碗蘚（Physcomitrella patens）中成功克隆了PpRan基因的開放閱讀框（ORF）序列，并對其編碼的氨基酸序列進行了相關分析。利用半定量PCR技術對PpRan基因在不同組織中以及受到缺磷脅迫時的表達研究發現，PpRan基因的表達具有組織特異性，莖葉體和原絲體中表達量較高，假根中表達量比較低；PpRan基因受缺磷脅迫誘導表達，隨著脅迫時間的延長表達量越來越高。這些結果表明，PpRan基因可能在小立碗蘚響應缺磷脅迫時發揮重要作用。

關鍵詞：小立碗蘚；PpRan基因；基因克隆；表達分析

中圖分類號：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）06-0015-05

磷是植物生長所必須的礦質元素，缺磷常導致植物的分枝比正常植株少，莖、根纖細，植株矮小，花果容易脫落等。但土壤中的磷一般不能滿足農作物生長發育的需要，必須通過施肥來補充，這無疑增加了作物種植的成本，也存在破壞生態環境的風險。因此，如能克隆與缺磷脅迫耐性相關的基因，并通過基因工程手段改良作物將對農作物經濟效益和生態環境都具有重要的作用。

GTP結合蛋白（GTP-binding protein）也叫G蛋白，廣泛存在于生物界，在細胞信號傳導中起著極為重要的作用。低分子量GTP結合蛋白的相對分子量通常在20～30 kD之間，根據分子量大小可以劃分為Ras、Rap、Seg、Arf等七種不同的亞類[1]。其中Ran（Ras-related nuclear）也稱為TC4[1]，在動物中參與調控細胞周期中各個時期的生命活動，如：調控核運輸、啟動細胞分裂、DNA復制、RNA的轉錄和加工（或修飾）、有絲分裂和減數分裂的開始和結束的控制、紡錘體的組裝、染色體的正確分配、核膜破裂和重組等。但到目前為止，關于Ran蛋白參與調控植物逆境脅迫反應的研究鮮有報道，尤其是對缺磷脅迫的耐性。

苔蘚植物是自然界的拓荒者之一，能生活于沙磧、荒漠、凍原地帶及裸露的石面或新斷裂的巖層上，這種生活的特性可能與其本身的分子調控機制相關。因此，本研究以小立碗蘚（Physcomitrella patens）為材料，對其Ran基因進行了克隆和相關表達模式的研究，不僅為了解Ran蛋白的生物學功能奠定了基礎，也為植物的抗逆育種提供了理論參考。

1 材料與方法

11 試驗材料

小立碗蘚由德國Ralf Reski 教授惠贈。

12 試驗方法

121 PpRan基因cDNA編碼序列的克隆 利用Trizol 法提取小立碗蘚總RNA，采用上海申能博彩生物科技有限公司的反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA 第一條鏈。利用NCBI上公布的小麥、水稻及擬南芥Ran基因的EST序列，通過BLAST比對找出小立碗蘚中同源的EST并進行拼接，找出PpRan的ORF，設計特異性引物分別為PpRan-F：5′-ATGGCATTGCCCGGGCAGCAGACTCC-3′和PpRan-R：5′-CTAGCTGTCAAAGGCGTCATCGTCGT-3′。以小立碗蘚反轉錄產物為模板進行PCR 擴增。擴增產物連pGEM-T easy vector System后測序驗證。

122 序列比對和系統進化樹分析 利用DNAMAN 軟件，對不同物種（小麥：Triticum aestivum，AAL303961；水稻：Oryza sativa Japanica Group，NP_0010435501；擬南芥：Arabidopsis thaliana，AAN318651；釀酒酵母：Saccharomyces cerevisiae S228C，NP_0148281；果蠅：Drosophila yakuba，XP_0021009021；小家鼠：Mus musculus，NP_033417；人Homo sapiens：NP_0063161）來源的Ran蛋白進行氨基酸多序列比對分析，采用默認參數設置。使用MEGA 40 對不同物種中的Ran蛋白做系統進化分析，采用Bootstrap Test -Neighbor Joining 方法，重復500 次運算。

123 PpRan基因在不同組織中的表達模式分析 用Trizol法分別提取小立碗蘚莖葉體、假根、原絲體組織的總RNA，反轉錄。分別以莖葉體、假根、原絲體的反轉錄產物為模板，利用PpRan-F/R引物PCR擴增PpRan基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測不同組織PpRan基因的表達水平。以小立碗蘚Actin基因（AW698983）作為內參，擴增引物為：PpActin-F：5′-CGGAGAGGAAGTACAGTGTGTGGA-3′和PpActin-R：5′-CTGGGCTCAATTCTAACGGCTGGT-3′。

124 小立碗蘚受缺磷脅迫時PpRan基因的表達模式分析 將小立碗蘚植株在不加入磷元素的固體培養基（培養基中的KH2PO4用等量的KCl代替）中培養，進行缺磷處理，以正常培養基培養的小立碗蘚作為對照。在處理后第1、2、4、7、9天取小立碗蘚假根，用Trizol法提取小立碗蘚假根RNA，反轉錄成cDNA。利用PpRan-F/R引物PCR擴增PpRan基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測不同處理時期PpRan基因的表達水平。并以小立碗蘚Actin基因作為內參，擴增引物同123。2 結果與分析

21 PpRan基因編碼區克隆及分析

經PCR擴增得到約為700 bp的DNA片段（圖1），將其命名為PpRan。經測序，PpRan ORF大小為672 bp，預測編碼223個氨基酸。將預測的氨基酸序列提交NCBI保守域數據庫進行比對，發現有5個Ras類GTP結合蛋白共有的保守區域（圖2），這些區域是GTP及其輔助因子結合的區域。其中，“GDGGTGKT”與GXXXXGK（S/T）功能區相對應，是磷酸結合位點；“YEPTIGVEV”為Effector Loop區域；“WDTAGQE”區域負責結合GFP的τ-磷酸；“NKVD”與NKXD功能結構域相對應，對鳥嘌呤有特異的介導作用；“EISA”與FMETSA區域相對應，可與NKXD區域的D殘基發生相互作用。

同源比對分析結果表明，PpRan編碼的氨基酸序列與擬南芥、水稻、小麥、釀酒酵母、人的相似性分別達到了89%、87%、86%、73%、71%（圖3）。在進化上與植物Ran蛋白具有更高的親緣

關系（圖4）。在動物中，Ran蛋白的C末端缺乏一個作為異戊二烯化受體位點的半胱氨酸殘基，擁有一個酸性的C末端序列DEDDDL，而植物中的C末端保守序列為DDDDDL，小立碗蘚是比較低等的植物，在進化上僅僅高于藻類，低于蕨類植物，其C末端保守序列與高等植物存在差異，為DDDDDA。

22 PpRan基因的表達模式分析

半定量RT-PCR分析發現，PpRan基因在莖葉體中的表達量最高，其次是在原絲體中，在假根中表達量很低（圖5A）。因此，PpRan基因的表達具有組織特異性。

由圖5B可以看出，受缺磷脅迫時PpRan基因表達量有所上升，并且隨著缺磷脅迫時間的延長，表達量越來越高，但處理后第7天和第9天沒有明顯變化，說明表達量維持在此水平。

A：PpRan基因在小立碗蘚不同組織中的表達模式，其中泳道1為假根，泳道2為莖葉體，泳道3為原絲體；B：PpRan基因對缺磷的響應，其中泳道1為對照，泳道2～6分別為缺磷處理后1、2、4、7、9天PpRan的表達

3 討論

本研究克隆了小立碗蘚Ran基因并對其序列進行測定，利用分子生物學分析軟件和網絡資源對測序結果進行分析，并根據基因序列和結構對其功能進行了預測。PpRan蛋白與其它植物有很高的同源性，屬于植物Ran蛋白家族的一個成員。Ran是Ras蛋白的一個亞類，具有Ras蛋白的共同特點，所有的Ras蛋白都有相似的結構域[2]：N端1～165氨基酸是Ras蛋白功能結構域，負責結合、水解GTP；不同種類的Ras蛋白之間的差異主要發生在166～185氨基酸殘基區域；Ras蛋白的C端有4個氨基酸殘基組成的CAAX-BOX，其中C為半胱氨酸Cys，A代表任何一種脂族氨基酸，CAAX-BOX使Ras蛋白吸附在膜上，而與膜結合是Ras蛋白實現其生理功能所必須的。本實驗從小立碗蘚中克隆得到的編碼低分子量GTP結合蛋白的PpRan基因，其編碼的氨基酸序列C端沒有4個氨基酸殘基組成的CAAX-BOX，而是一段呈酸性的序列“PLPDDDDDA”，這與大多數Ras蛋白的特點不同，可能是PpRan蛋白為核蛋白，與擬南芥[3]、煙草[4]、馬鈴薯[5]的Ran蛋白相同，都是可溶的，存在于細胞質和細胞核中，不需要錨定在膜上。

本實驗對小立碗蘚不同組織中的PpRan基因的表達情況做了研究，發現在莖葉體中表達量最高，在原絲體組織中的表達量次之，假根中表達量最低，說明PpRan在小立碗蘚中的表達具有組織特異性。可能莖葉體是小立碗蘚最成熟、光合作用等發生的部分，因此表達量較高；原絲體是二維狀態的小立碗蘚組織，只是小立碗蘚發育的一個過渡階段，因此表達量較莖葉體次之；假根不是傳統意義上的根，可能生活力較弱，表達量最低。在缺磷條件下，增強低濃度有效磷吸收能力是植物抵抗非生物脅迫所采取的一種適應機制，而這一機制的實現需要高親和力Pi轉運子的高效表達。李玉京等[6]認為在缺磷條件下植物對PO3-4吸收能力的增強信號，可能來自于植物體內PO3-4濃度的變化。我們推測PpRan蛋白也可能參與了這一信號的傳導。Bun-ya等[7]在釀酒酵母Scerevisae中，分離到編碼小G蛋白的Gtr1基因，該基因不僅參與調控酵母細胞分裂、生長的信號傳導，而且和PH084 Pi轉運子共同參與對Pi的吸收。本實驗對小立碗蘚進行缺磷處理，半定量PCR發現，小立碗蘚假根中PpRan基因的表達量隨著磷缺乏時間的延長而升高，這表明PpRan基因受缺磷脅迫的誘導，推測其可能在小立碗蘚對缺磷脅迫應激反應中起著重要的作用。本實驗結果與高建偉[8]對藍粒小麥Ta-Ran 1的磷饑餓脅迫的誘導表達結果一致。由于小立碗蘚在進化上低于小麥，本實驗結果也說明了Ran-like基因在低等植物里也顯示出在高等植物中相似的功能。

小立碗蘚PpRan全長cDNA編碼序列的獲得以及該基因在不同組織和在非生物脅迫條件下的表達特性研究結果，為進一步研究其在非生物脅迫應答基因網絡中的調控模式奠定了基礎。PpRan基因編碼蛋白的生物學功能還需進一步的研究。參 考 文 獻：

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[6] 李玉京 高親和力PO3-4轉運子編碼基因的cDNA克隆及特征分析[D]北京：中國科學院植物研究所，1999

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[8] 高建偉藍粒小麥藍色糊粉層色素合成及其色素合成途徑相關基因的克隆以及編碼小麥小Ras類GTP結合蛋白（Ran）基因的cDNA克隆及其表達特性分析[D]北京：中國科學院遺傳與發育研究所，2001