茶樹抗寒育種及轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

孫海偉 曹德航 尚濤等

作者簡介：孫海偉（1973-），男，博士，副研究員，主要從事茶樹、果樹遺傳育種研究。

摘要：茶樹[Camellia sinensis（L）OKuntze]是原產(chǎn)我國的葉用木本植物，山東自“南茶北引”取得成功以來，冬季低溫脅迫導(dǎo)致的凍害常造成經(jīng)濟(jì)損失。所以，抗寒育種研究一直是茶樹研究的熱點和難點。本文闡述了茶樹抗寒育種的研究進(jìn)展，包括抗寒性研究、選育的抗寒品種、抗寒基因的分離和鑒定及轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：茶樹；抗寒育種；抗寒基因；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：S571.103.4 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）06-0119-05

茶樹[Camellia sinensis（L）OKuntze]屬山茶科，山茶屬，原產(chǎn)于我國西南地區(qū)，是一種喜溫暖氣候條件的葉用植物。隨著人們對茶葉保健功能的認(rèn)識，茶葉需求量逐年增加，茶樹栽培面積不斷擴(kuò)大，種植區(qū)域不斷向北方拓展。山東省是我國的次適宜高緯度茶區(qū)，由于冬季氣溫低、持續(xù)時間長，茶樹極易受到凍害影響，給茶葉生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失。自20世紀(jì)50年代末嘗試引種茶樹以來，山東茶樹引種栽培面積已經(jīng)達(dá)到167×104 hm2[1]，幾乎每年都要遭受不同程度的低溫凍害，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，抗寒育種成為茶樹育種研究的熱點。

1 茶樹抗寒性的研究

茶樹的抗寒性是在茶樹長期適應(yīng)低溫脅迫的過程中通過自然選擇而逐步發(fā)展和形成的一種形態(tài)和生理特征。茶樹等溫帶地區(qū)的常綠闊葉樹種在抗寒機(jī)理上與草本植物和落葉木本植物有所不同：與草本植物相比，其冷馴化能力大得多，冷馴化機(jī)制更為復(fù)雜；與落葉木本植物相比，盡管具有季節(jié)性生長調(diào)節(jié)的特性，但其越冬葉卻沒有落葉木本植物葉那種遇冷引發(fā)的衰老、脫落過程，也不存在類似芽的內(nèi)生性休眠過渡。研究者們先后從葉片的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)變化、束縛水含量、細(xì)胞液濃度、保護(hù)酶類（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等酶類）、低溫膜損傷、茶樹冰核活性細(xì)菌等多方面探索了茶樹的抗寒機(jī)理[2～11]，也找到了相應(yīng)的技術(shù)措施來提高茶樹抗寒能力，但是幾乎所有措施都需要投入大量的人力、物力、財力[1]。選育抗凍能力突出的良種，改良茶樹自身的遺傳因素來提高抗寒性能以抵御低溫脅迫是解決這一問題最根本的方法[12]。

何孝延[2]對30份烏龍茶品種資源進(jìn)行抗寒性鑒定，結(jié)果表明，從整體而言，福建烏龍茶品種間的抗寒性無明顯差異，均表現(xiàn)為較抗寒類型。梅麗等[3]以從山東省茶葉主要產(chǎn)區(qū)（泰安市、青島市、日照市）采集的共計51個茶樹類型和品種的葉片為材料，對其內(nèi)部結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系、內(nèi)部結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)力指數(shù)的關(guān)系和束縛水含量進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)山東引種茶樹由于樣品間的差異以及所處地區(qū)的不同，抗寒能力與生產(chǎn)力指數(shù)均表現(xiàn)出明顯的差異；在所用的樣品中，抗寒能力勁峰最強，生產(chǎn)力指數(shù)福鼎大白毫最高，束縛水含量類型3最高、云南小葉最低；相關(guān)性分析表明，對山東引種茶樹進(jìn)行抗寒性評價時除了依據(jù)柵欄組織/海綿組織之外，柵欄組織細(xì)胞數(shù)目也是一個重要的評價指標(biāo)；束縛水的含量與基于葉片解剖結(jié)構(gòu)計算的抗寒性指標(biāo)之間未見明顯的相關(guān)性，而束縛水含量/自由水含量與基于葉片解剖結(jié)構(gòu)計算的抗寒性指標(biāo)之間可見一定程度的正相關(guān)；進(jìn)行生產(chǎn)力評價時除了依據(jù)柵欄組織厚度與柵欄組織細(xì)胞數(shù)目之外，葉肉組織厚度與葉全厚度也是比較可靠的評價指標(biāo)，基于葉片解剖結(jié)構(gòu)計算的抗寒性指標(biāo)與生產(chǎn)力指數(shù)之間呈不顯著的正相關(guān)。孫銳等[4]選取山東引種茶樹的抗寒性較強的勁峰和抗寒性較弱的黃早作為材料，在冰凍脅迫條件下觀察細(xì)胞、組織水平的結(jié)構(gòu)變化，評價凍害的影響和受凍的原因，并且探討了細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器對凍害表現(xiàn)出的不同穩(wěn)定性。孫仲序等[5]經(jīng)對山東10地市茶區(qū)、6個氣象因子作最短距離聚類分析得出，山東茶主要分布在4個生態(tài)類型區(qū)域內(nèi)，茶樹凍害由輕到重呈花斑式分布；各氣象因子與葉片組織結(jié)構(gòu)變化呈正相關(guān)性，以年降水量和極端最低溫度對茶樹變異影響最大，其次是年平均溫度、無霜期和日照時數(shù)，1月份年均氣溫對葉片結(jié)構(gòu)變化影響不大；葉片結(jié)構(gòu)以柵欄組織厚度對氣候條件最敏感，其次是柵欄組織與海綿組織的比值、海綿組織厚度，葉片厚度和上表皮厚度與氣象因子無關(guān)。楊亞軍等[7]研究了冷馴化和ABA對茶樹抗寒力及其體內(nèi)脯氨酸含量的影響，結(jié)果表明，通過冷馴化或者ABA處理，茶樹經(jīng)歷了馴化再到脫馴化的過程，其抗寒力也相應(yīng)地發(fā)生了很大的變化，由馴化前的幾乎為零逐漸提高，而隨著脫馴化的進(jìn)行又迅速恢復(fù)到馴化前的水平；低溫馴化的臨界溫度為7℃左右，脫馴化的臨界溫度為9℃左右；人工低溫馴化和ABA處理，茶樹抗寒力的提高幅度沒有自然冷馴化下的大；冷馴化中茶樹體內(nèi)脯氨酸含量變化是對外界條件變化的一種綜合反應(yīng)，很難說明單一的脯氨酸含量與抗寒力之間的因果關(guān)系。楊華等[13]采用以生物膜學(xué)說為依據(jù)的電導(dǎo)法，經(jīng)過不同低溫脅迫處理對川茶群體種、平陽特早、烏牛早、云南大葉種等4個茶樹品種的新梢（一芽三葉）和成熟葉片組織進(jìn)行了抗寒性測定，并結(jié)合Logistic方程分別計算了各茶樹品種的低溫半致死溫度（LT50），列出了供試品種抗寒性的相對強弱順序為：平陽特早>烏牛早>川茶群體種>云南大葉種。

2 茶樹抗寒育種研究

多年來，茶樹育種研究工作者不斷選育出抗寒性茶樹品種（系）。如前蘇聯(lián)研究人員用中國種和印度種的雜交種混合花粉進(jìn)行輔助授粉，培育的格魯吉亞系7、8、12號，可以在-20℃的嚴(yán)寒地區(qū)栽培過冬。日本用茶和茶梅進(jìn)行種間雜交所獲得的茶梅系，其抗凍性大大提高[1]。近年來我國也相繼獲得了一些抗寒性強的優(yōu)良品種，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系選育出特早生特抗寒茶樹新品種“農(nóng)抗早”和早生抗寒優(yōu)質(zhì)茶樹新品系“茶農(nóng)1號”[14，15]。浙江大學(xué)茶葉研究所選育出早生優(yōu)質(zhì)抗寒茶樹新品種“浙農(nóng)117” [16]。泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院選育出“羅漢1號”[17]。由于茶樹為多年生木本植物，選育一個良種周期較長，且大部分品種的抗寒能力并沒有得到顯著改善，在生產(chǎn)中仍然會發(fā)生凍害。因此，利用輻射誘變、轉(zhuǎn)基因等各種育種方法將抗性基因轉(zhuǎn)移入農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種（系）中去，培育出優(yōu)質(zhì)高抗的新品種（系），會大大縮短常規(guī)育種的周期，獲得事半功倍的效果[6]。進(jìn)行茶樹抗性的轉(zhuǎn)基因育種，是茶樹抗性突破性育種的一個重要手段。下一步，應(yīng)加大對茶樹重要相關(guān)功能基因的研究投入，摸清主要性狀的遺傳規(guī)律和相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，為茶樹的定向育種和分子育種奠定理論基礎(chǔ)。3 茶樹抗寒基因的分離和鑒定

近幾年，隨著擬南芥等模式植物抗寒機(jī)理系統(tǒng)研究的深入，茶樹抗寒分子機(jī)制研究出現(xiàn)熱潮。陳喧等[18]發(fā)現(xiàn)茶樹CBF基因只有低溫誘導(dǎo)后才會表達(dá)，低溫誘導(dǎo)4 h開始表達(dá)，在8 h左右表達(dá)量最高，然后開始下降，但仍維持在一個較高的水平。在植物抗寒途徑中，COR作為一種重要的冷應(yīng)答蛋白，被CBF激活后，激活一系列下游基因表達(dá)，抵抗低溫。梅菊芬等[19]采用mRNA差別顯示的方法對茶樹冷馴化過程中基因差異表達(dá)進(jìn)行了初步研究，從58條差異片段中得到穩(wěn)定擴(kuò)增的差異片段23條，用RT-PCR方法鑒定其假陽性，得到5個陽性片段，其中3個片段在冷馴化過程中表達(dá)量增加，另外2個片段的表達(dá)量降低。陳林波等[20]以中小葉茶樹良種舒茶早和云南大葉種73-11為材料，于4℃低溫處理4 d后，采用AFLP技術(shù)篩選出冷誘導(dǎo)下茶樹差異表達(dá)基因并進(jìn)行分析，結(jié)果獲得41個差異片段（TDFs），按功能可劃分為4類，即信號傳導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、基礎(chǔ)代謝相關(guān)蛋白、抗逆蛋白質(zhì)，此外還有一些假設(shè)蛋白質(zhì)及未知蛋白；利用qRT-PCR方法對Kh1、Kh3和Kh11差異片段進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示這3個片段均被低溫誘導(dǎo)，表達(dá)量上升。房婉萍等[21]利用cDNA-AFLP的方法分離克隆了茶樹中的H1-histone基因，BLAST比對結(jié)果顯示，該片段與其它物種逆境誘導(dǎo)特異表達(dá)的H1-histone基因有很高的相似性，與煙草H1-histone基因編碼的氨基酸序列一致性達(dá)79%。冷脅迫條件下，茶樹的H1-histone在代謝中轉(zhuǎn)化為H1-S，H1-S的聚集會改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，對逆境信號進(jìn)行響應(yīng)，調(diào)控下游的一系列蛋白或響應(yīng)因子做不同形式的表達(dá)，與冷脅迫直接相關(guān)的基因CBF、COR、ICE的啟動與調(diào)控都可能與H1-histone基因的調(diào)控相關(guān)。張莉等[22]利用cDNA-AFLP分析在-70℃貯藏1年后的茶籽基因表達(dá)，篩選到10個低溫差異表達(dá)片段，其中有7個與MYB類轉(zhuǎn)錄因子等有較高同源性。李先文等[23]運用RACE技術(shù)從茶葉中克隆出一個冷誘導(dǎo)基因CsCOR1的全長cDNA序列，并通過Real-time RT PCR方法分析了該基因在低溫、高滲和外源ABA處理時的表達(dá)狀況，結(jié)果顯示CsCOR1基因的表達(dá)可被低溫和脫水脅迫劇烈上調(diào)，可被外源ABA中度上調(diào)。鄒中偉等[24]利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得了茶樹低溫表達(dá)的86個差異片段，在選擇回收的10條差異表達(dá)cDNA片段中，有4個片段與低溫脅迫有關(guān)。4 茶樹轉(zhuǎn)基因的研究

自20世紀(jì)90年代開展茶樹再生體系及基因遺傳轉(zhuǎn)化研究以來，一直未有很大的進(jìn)展，大量的工作都停留在轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的階段。在研究人員的積極探索下，雖然有少量通過轉(zhuǎn)化體胚得到轉(zhuǎn)基因植株的報道，但茶樹體胚的誘導(dǎo)體系仍未建立[25～31]。目前只有Bt基因、蛋白溶解酶基因嘗試向茶樹中轉(zhuǎn)化，但由于茶樹離體再生困難，受過創(chuàng)傷的茶樹受體轉(zhuǎn)化后的再生效率低，最終轉(zhuǎn)基因成功的報道僅1例[32]，而且還是通過嫁接轉(zhuǎn)基因嫩梢獲得的轉(zhuǎn)基因植株。

茶樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問題有：一是轉(zhuǎn)化效率低。茶樹中富含多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)一方面作為一種抑菌劑，直接殺死農(nóng)桿菌而影響轉(zhuǎn)化率；另一方面作為蛋白質(zhì)的沉淀劑，阻塞發(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA向茶樹細(xì)胞運轉(zhuǎn)的通道，從而間接影響茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化。迄今國內(nèi)外農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化成功率低的主要原因是缺乏穩(wěn)定完善的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系。二是茶樹離體再生困難。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系依賴于高頻的再生體系。茶樹的離體再生難度大，特別是器官發(fā)生途徑的植株再生。除子葉容易產(chǎn)生體細(xì)胞胚外，茶樹的各種器官都不容易再生，茶樹的莖段有再生成功的報道，但芽再生頻率很低，尚不明確哪種組織的再生能力強[33～36]。這些可能是導(dǎo)致部分遺傳轉(zhuǎn)化失敗的主要原因。現(xiàn)代植物育種技術(shù)發(fā)展迅速，轉(zhuǎn)基因等新的育種手段已經(jīng)在其他植物上取得成功。今后，茶樹育種應(yīng)借鑒其它植物成功的經(jīng)驗，加強技術(shù)攻關(guān)，在茶樹穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、轉(zhuǎn)基因育種等方面做好技術(shù)儲備。

5 展望

來自熱帶和亞熱帶的許多作物缺乏冷馴化的能力，無法在溫帶以北的地區(qū)露地安全越冬，只有完成低溫馴化才可能忍耐較低的溫度而不受傷害。在馴化過程中涉及大量的基因表達(dá)重組和代謝變化，經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明植物冷馴化能力是由微效多基因共同控制的數(shù)量性狀[37]。傳統(tǒng)的育種方法在改善植物耐凍性方面取得的成效非常有限，對提高植物抗寒性的作用不大[38]，例如到目前為止小麥品種和油菜品種抗寒性，只比幾百年前的品種稍微有點改善[39，40]。

茶樹起源于亞熱帶，多年生木本植物，由于生長周期長，采用常規(guī)抗寒育種技術(shù)進(jìn)行新品種選育所需時間長、見效慢，同時還存在基因源缺乏、雜合程度高和雜交不親和等制約因素。所以，通過確定茶樹抗凍基因的性質(zhì)，了解其感受低溫和調(diào)控抗凍性表達(dá)機(jī)制，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)改進(jìn)其遺傳組成，進(jìn)行抗凍性分子改良，具有高效性和針對性，可彌補常規(guī)育種技術(shù)的不足，加速高抗凍性茶樹新品種的選育進(jìn)程。

當(dāng)前我國茶樹抗寒性和抗寒育種研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但在抗寒分子機(jī)制、轉(zhuǎn)基因研究等方面還缺乏深入研究，下一步還需要遺傳學(xué)、育種學(xué)、生理學(xué)、植物保護(hù)學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科長期不懈的協(xié)作，開創(chuàng)茶樹抗寒分子育種研究的新局面。

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