雌激素藥物對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥OPN、MMP—9表達(dá)的影響

翁科娜　趙蕾　陳波

摘要] 目的 探討雌激素藥物（丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮）對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）OPN、MMP-9表達(dá)的影響。 方法 將建模成功的36例實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)性地均分為四組，各9例，分別給予丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮三種雌激素類(lèi)藥物干預(yù)，另外使用酵母片進(jìn)行干預(yù)，1個(gè)月后將大鼠殺死，將其在位與異位內(nèi)膜取出，運(yùn)用RT-PCR法對(duì)OPN與MMP-9蛋白及基因表達(dá)進(jìn)行分析、測(cè)定。 結(jié)果 三組雌激素藥物干預(yù)組干預(yù)后在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜中的OPN與MMP-9的表達(dá)均要明顯低于干預(yù)前，且干預(yù)前后差異存在高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；對(duì)照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中的OPN與MMP-9的表達(dá)要強(qiáng)于在位內(nèi)膜；三組雌激素干預(yù)組干預(yù)后在位與異位內(nèi)膜OPN表達(dá)無(wú)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但干預(yù)后雌激素干預(yù)組異位內(nèi)膜中MMP-9表達(dá)明顯強(qiáng)于在位內(nèi)膜（P < 0.01）；對(duì)照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中OPN mRNA的表達(dá)較干預(yù)前出現(xiàn)顯著性降低（P < 0.01），且在位與異位內(nèi)膜的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 雌激素類(lèi)藥物能夠降低大鼠在位及異位內(nèi)膜中OPN與MMP-9的表達(dá)能力，且對(duì)異位內(nèi)膜中的OPN表達(dá)能力的抑制作用要明顯強(qiáng)于在位內(nèi)膜，對(duì)在位內(nèi)膜中的MMP-9表達(dá)能力的抑制性作用不亞于對(duì)異位內(nèi)膜；雌激素類(lèi)藥物可能通過(guò)對(duì)局部病灶OPN及MMP-9表達(dá)能力的抑制作用進(jìn)行抑制來(lái)減小細(xì)胞的侵襲及黏附性能。

[關(guān)鍵詞] EMS模型鼠；丙氨瑞林；米非司酮；孕三烯酮；子宮內(nèi)膜異位癥；OPN；MMP-9

[中圖分類(lèi)號(hào)] R711.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）06-0004-06

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）雖然為一種良性的婦產(chǎn)科疾病，但具有非常明顯的異地黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等類(lèi)似于惡性腫瘤的生物學(xué)行為[1]。骨橋蛋白（osteopontin， OPN）屬于一種細(xì)胞信息傳導(dǎo)通路中的重要的磷酸化基質(zhì)蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、侵襲以及抗凋亡能力等方面的生成[2]。MMP-9與MMP-2能夠一同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽，從而促使新生血管的形成，在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位黏附、種植以及生長(zhǎng)的過(guò)程中扮演著極為重要的角色[3，4]。本研究采用實(shí)驗(yàn)的形式，根據(jù)移植法的相關(guān)要求及內(nèi)容，構(gòu)建EMS動(dòng)物模型，對(duì)OPN、MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的在位及異位病灶中蛋白與基因表達(dá)方面的差異性進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康性成熟未交配的36只SD雌性大鼠，體重為205～243 g，平均體重（225.2±33.1） g，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 RT-PCR所需要的引物以及相應(yīng)的試劑均購(gòu)自于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2.2 試劑 一抗OPN（SC-21742）以及PV-9000二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自于北京中杉金橋有限公司，MMP-9購(gòu)自于北京博奧深有限公司；丙氨瑞林（上海麗珠制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050306）；米非司酮（浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20064188）；孕三烯酮（秦皇島紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19980003）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取建模成功的36只大鼠隨機(jī)性地均分為以下四組，每組9只：①對(duì)照組：酵母片半片/d，連續(xù)用藥1個(gè)月；②丙氨瑞林組（GnRH組）：GnRH 7.5 μg/250 g皮下注射每天1次，連續(xù)使用1個(gè)月；③米非司酮組：0.62 mg/250 g每日1次，連續(xù)使用1個(gè)月；④孕三烯酮組：0.062 mg/次，每周使用兩次，連續(xù)使用1個(gè)月。兩組大鼠均取在位內(nèi)膜以及異位內(nèi)膜組織。所取組織可以分為如下兩個(gè)部分：一部分取材之后立即于-80℃溫度條件下進(jìn)行冷凍保存（PCR實(shí)驗(yàn)用），另外一部分做成石蠟標(biāo)本（免疫組化用）[5-7]。

1.4 免疫組化SP法檢測(cè)OPN、MMP-9的表達(dá)

免疫組化步驟應(yīng)嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)上的操作說(shuō)明來(lái)進(jìn)行，切片經(jīng)過(guò)DAB顯色之后在高倍鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。上述四組干預(yù)前后在位以及異位內(nèi)膜組織的切片均隨機(jī)取5個(gè)重疊度低的高倍鏡視野（實(shí)驗(yàn)中選擇400倍最佳），應(yīng)用Image Proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每高倍鏡視野之下的OPN以及MMP-9的積分吸光度值（IOD）的均值[8，9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中的數(shù)據(jù)均由SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP法條件下四組內(nèi)膜中OPN的表達(dá)

SP法條件下，對(duì)照組干預(yù)前后OPN的表達(dá)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜治療前后OPN的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 SP法條件下四組內(nèi)膜中MMP-9的表達(dá)

對(duì)照組干預(yù)前后在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜MMP-9的表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜治療前后MMP-9的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 RT-PCR檢測(cè)兩組組織中的OPN mRNA及MMP-9 mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)時(shí)對(duì)照組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜干預(yù)前后OPN mRNA及MMP-9 mRNA的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜治療前后OPN mRNA及MMP-9 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表3、表4。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展與多種綜合性因素有著一定的關(guān)系，其中MMP-9、OPN就是其中兩大影響因子，越來(lái)越多地被臨床實(shí)踐研究證實(shí)，此兩種影響因子與EMS的進(jìn)展密切相關(guān)[10]。MMP-9屬于一種明膠酶，它能夠?qū)?xì)外基質(zhì)以及基底膜的成分加以降解，通過(guò)多種綜合性的途徑來(lái)促進(jìn)EMS的發(fā)生與發(fā)展。OPN屬于一種磷酰化、具有親水性的酸性分泌型糖蛋白，它含有絲氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸基團(tuán)類(lèi)物質(zhì)，能夠有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的趨化、黏附以及遷移等過(guò)程[11，12]。

國(guó)內(nèi)外研究表明，OPN能夠促使內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)量增多、侵襲以及轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)內(nèi)膜異位癥的發(fā)展。相關(guān)學(xué)者在對(duì)人類(lèi)內(nèi)膜異位癥的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物治療后內(nèi)膜異位癥患者組織中的MMP-9以及OPN的表達(dá)能力急劇降低，并認(rèn)為MMP-9、OPN能夠作為反映EMS發(fā)生與發(fā)展的指示性物質(zhì)。許多雌激素類(lèi)藥物會(huì)對(duì)OPN、MMP-9的表達(dá)起到一定的抑制作用。本文主要對(duì)三類(lèi)雌激素類(lèi)藥物，即丙氨瑞林、米非司酮、孕三烯酮對(duì)大鼠OPN、MMP-9的表達(dá)的作用進(jìn)行研究。本研究表明，三組雌激素藥物干預(yù)后在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜中的OPN、MMP-9的表達(dá)均明顯低于干預(yù)前，且干預(yù)前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；對(duì)照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中的OPN、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于在位內(nèi)膜；三組雌激素干預(yù)后在位與異位內(nèi)膜OPN表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是干預(yù)后雌激素干預(yù)組異位內(nèi)膜中MMP-9表達(dá)明顯強(qiáng)于在位內(nèi)膜（P < 0.01）；對(duì)照組干預(yù)后異位內(nèi)膜中OPN mRNA的表達(dá)較干預(yù)前出現(xiàn)顯著性降低（P < 0.01），且在位與異位內(nèi)膜的表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

綜上所述，雌激素類(lèi)藥物能夠降低大鼠在位及異位內(nèi)膜中OPN與MMP-9的表達(dá)能力，且對(duì)異位內(nèi)膜中的OPN表達(dá)能力的抑制作用明顯強(qiáng)于在位內(nèi)膜，對(duì)在位內(nèi)膜中的MMP-9表達(dá)能力的抑制性作用不亞于對(duì)異位內(nèi)膜；雌激素類(lèi)藥物可能通過(guò)對(duì)局部病灶OPN及MMP-9表達(dá)能力的抑制作用進(jìn)行抑制來(lái)減小細(xì)胞的侵襲及黏附性能。

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（收稿日期：2012-12-13）