口服積雪苷和槲皮素對兔耳增生性瘢痕的影響

黃久佐　王曉軍

[摘要]目的：探討口服積雪苷和槲皮素對兔耳增生性瘢痕的影響。方法：新西蘭大白兔9只，在兔耳腹側制備標準創面（每耳4個，共72個），隨機分為3組：空白對照組、積雪苷組及槲皮素組。4周后收集標本，從瘢痕橫截面最高點制作切片，比較各組的瘢痕增生指數。結果：積雪苷組（1.55±0.03）與空白對照組（1.67±0.02）相比，瘢痕增生指數明顯降低（17.9%），有統計學顯著性差異（P=0.003）。槲皮素組（1.59±0.03）與空白對照組相比，兩者瘢痕增生指數無統計學顯著性差異（P=0.053）。結論：口服積雪苷可顯著抑制兔耳瘢痕增生，口服槲皮素對兔耳增生性瘢痕的抑制作用尚待進一步實驗證實。

[關鍵詞]增生性瘢痕；積雪苷；槲皮素

[中圖分類號]R619+.6 Q136 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）05-539-03

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成機制不明，治療效果欠佳，是整形外科面臨的難題之一。積雪苷是從傘形科植物積雪草提取的有效成分，已有外用積雪草苷對兔耳增生性瘢痕模型療效的研究，且臨床已用于治療多種疾病，如黃褐斑、局限性硬皮病及瘢痕疙瘩等。槲皮素是廣泛存在于自然界的天然物質，前期體外實驗結果提示其可能通過多條信號通路抑制病理性瘢痕。本實驗建立增生性瘢痕動物模型，實驗動物口服積雪苷和槲皮素，通過計算和比較瘢痕增生指數探索對增生性瘢痕的影響，從而為臨床上防治增生性瘢痕尋找新的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器：9只新西蘭大白兔，體重2.5～3.0kg，雌雄不限，由北京協和醫院動物房提供。槲皮素（美國Sigma公司）；積雪苷（上海秀龍中藥有限公司）；光學顯微鏡（德國Leica DM3000以及德國Leica S8AP0）、顯微鏡攝像頭（德國Leica DFC 420C）。

1.2 兔耳瘢痕模型的制作：氯胺酮（2mg/kg）和地西泮（5mg/kg）肌肉注射麻醉，選取兔耳腹側的少毛區，在無菌條件下用皮膚活檢器及手術刀切除表皮、真皮及軟骨膜，保留軟骨。每耳制備4個直徑7mm的標準創面。壓迫止血，用Tegaderm透明敷料（3M公司）覆蓋創面。所有創面都在術后14天之前完成再上皮化，術后14天移除透明敷料。9個創面出現軟骨干燥和瘢痕內陷（對照組2個，積雪苷組4個，槲皮素組3個）。術后29天共回收63個增生性瘢痕標本（對照組22個，積雪苷組20個，槲皮素組21個）。

1.3分組給藥：積雪苷組，每天用含36mg積雪苷的藥液進行1次灌胃處理；槲皮素組，每天用含100mg槲皮素的藥液進行1次灌胃處理。給藥處理從手術當天開始，每天給藥1次，直至術后第28天。對照組不給藥。

1.4 標本收集和處理：術后第29天，切取標本，包括瘢痕及其周圍直徑5mm的正常皮膚。從瘢痕最高處制作切片，4%甲醛緩沖液固定48h，80%～100%酒精梯度脫水，二甲苯兩次透明，浸蠟3h（更換3次石蠟），石蠟包埋（65℃），制作厚度4μm的組織切片。切片經干燥、脫蠟后蘇木素染色5min，0.5%鹽酸酒精溶液分化5s，稀氨水沖洗30s，0.5%伊紅復染2min，再經常規脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5組織學檢查：用德國Leica S8AP0光學顯微鏡上的Leica DFC 420C相機拍攝用于定量計算瘢痕增生指數的數碼照片，用德國Leica DM3000光學顯微鏡上的Leica DFC 420C相機拍攝用作組織學定性分析的數碼照片。用Leica Qwin Plus圖像處理軟件，對每個瘢痕的橫截面進行測量（如圖1所示），取兩次測量所得數據的平均值。基線面積定義為在顯微鏡下觀察到的與周圍正常皮膚持平的軟骨之上的瘢痕面積（即圖中 部分面積）。基線面積的厚度為其周圍正常無瘢痕皮膚的厚度，長度則以隆起的增生性瘢痕與周圍無瘢痕的正常皮膚為界。而增生面積則定義為在基線面積之上（不含表皮面積）的瘢痕面積（即圖中 部分面積）。瘢痕增生指數是創面的總面積（即基線面積與增生面積之和）除以增生性瘢痕之下的組織面積（即基線面積）得到的比值。若瘢痕增生指數為1，則表示瘢痕的高度與周圍正常未受創傷的皮膚相同，即瘢痕未發生增生；若增生指數>1，則表示出現了隆起的增生性瘢痕。

1.6統計學分析：用SPSS 17.0軟件對各組數據進行獨立樣本t檢驗。P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 大體情況：空白對照組瘢痕塊顏色較紅、質地較硬、瘢痕高出皮膚平面，增生范圍未超出原創緣；積雪苷組和槲皮素組瘢痕顏色偏淡，質較軟，瘢痕較平。

2.2 病理結果：在低倍鏡下（×10）可見（圖2.1），對照組瘢痕明顯高于周圍皮膚；積雪苷組瘢痕與周圍皮膚高度相似，未見明顯隆起；槲皮素組瘢痕有一部分高于周圍皮膚。在較高倍數下（×50）可見（圖2.2），對照組瘢痕可見成纖維細胞在真皮淺層排列混亂，呈旋渦狀/結節狀，在真皮深層排列與皮膚平行。積雪苷組瘢痕真皮的成纖維細胞數量明顯少于對照組瘢痕，而且排列較規則。槲皮素組瘢痕的成纖維細胞在真皮淺層排列混亂，呈旋渦狀/結節狀，在真皮深層排列與皮膚平行。

2.3瘢痕增生指數：對照組的瘢痕增生指數為1.67±0.02（n=22），積雪苷組的瘢痕增生指數則為1.55±0.03（n=20），結果有統計學顯著性差異（P=0.003），積雪苷組的瘢痕增生程度比對照組減少17.9%；槲皮素組的瘢痕增生指數為1.59±0.03（n=21），與對照組相比無統計學顯著性差異（P=0.053），槲皮素組的瘢痕增生程度比對照組減少11.9%。槲皮素組的瘢痕增生指數與積雪苷組相比則無顯著性差異（P=0.271）。

3 討論

1997年，Morris[1]等建立了兔耳增生性瘢痕模型。國內李薈元[2]等從1998 年起也建立了該模型。之后李希軍[3]等也成功復制本模型。已有研究表明，兔耳增生性瘢痕從組織學至分子生物學水平均與人類增生性瘢痕相似[4]。本研究中共制作72處創面，形成增生性瘢痕63個，成功率為87.5%，與既往研究結果類似。

積雪草苷已在臨床上用于治療多種皮膚疾病，如皮膚潰瘍、局限性硬皮病以及瘢痕疙瘩等，且已經證實外用積雪草苷對兔耳增生性瘢痕的療效[5]。臨床上有外用的積雪苷霜劑、積雪苷注射液及口服的積雪苷片劑等多種劑型，本實驗發現口服積雪苷可以將兔耳瘢痕的增生程度減少19.7%，與對照組相比結果有統計學極顯著性差異（P<0.001）。積雪苷抑制兔耳增生性瘢痕的機制可能是通過促進Smad7[6]表達和減少TGF-β1 mRNA的表達[7]。但由于中藥本身成分復雜，其具體作用機理往往是多靶點、多環節的，需要更深層次的研究為其臨床治療提供有力的依據。

槲皮素廣泛存在于洋蔥、葡萄、蘋果、茶等植物中，是人類及動物可以從食物中攝取的天然物質。體外實驗的研究結果提示，槲皮素可以通過多條信號通路發揮抑制病理性瘢痕的作用[8]。但是目前外用槲皮素對病理性瘢痕抑制作用的動物實驗[9]和臨床試驗[10]結果均為陰性。本研究采用兔耳增生性瘢痕的動物模型探索口服槲皮素的療效，結果發現經槲皮素處理之后，瘢痕增生程度比對照組減少11.9%，但統計學上無顯著性差異（P=0.0053）。我們之前的研究發現，槲皮素可增強放射線對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原合成的抑制效應[8]，因此今后可進一步開展實驗探索槲皮素作為放療增敏劑對抑制瘢痕增生的作用。

[參考文獻]

[1]Morris DE， Wu L， Zhao LL， et al. Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring： quantitative studies[J]. Plast Reconstr Surg， 1997， 100（3）： 674-681.

[2]李薈元，劉建波，蘭海. 建立增生性瘢痕動物模型[J]. 第四軍醫大學學報， 1998， 19（6）： 655-657.

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[收稿日期]2012-10-21 [修回日期]2012-12-22

編輯/張惠娟