脂氧素A₄在大鼠急性肝衰竭中的作用

[摘要] 目的 觀察脂氧素A4 （LXA4）對大鼠急性肝衰竭的保護作用。 方法 使用D-氨基半乳糖（D-GalN）+脂多糖（LPS）建立大鼠急性肝衰竭動物模型。實驗分為6組：正常組、模型組、LXA4 小、中、大劑量組、四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯（PDTC）組。檢測肝臟炎癥變化、炎性細胞因子水平、凋亡指標等表達。 結果 大鼠急性肝衰竭時，肝臟轉氨酶明顯升高，肝組織炎癥壞死明顯，組織學評分明顯升高，血清IL-6及TNF-α及肝組織TNF-α mRNA及IL-6 mRNA水平明顯升高；脂氧素組及PDTC組肝臟轉氨酶明顯下降，組織學改變均明顯好轉；脂氧素大劑量組與PDTC組比較，上述大部分指標之間差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 LXA4 對大鼠急性肝衰竭有保護作用，可減少致炎性細胞因子的分泌。

[關鍵詞] 脂氧素A4；急性肝衰竭

[中圖分類號] R575.3 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）07-38-03

脂氧素是1984年由Serhan發現的一類花生四烯酸的代謝產物，其包括脂氧素A4和脂氧素B4，在炎癥等病理過程中發揮廣泛的抗炎促消退作用。脂氧素A4是體內重要的內源性促炎癥消退介質，是炎癥反應的重要“剎車信號”[1]。目前國內外對LXA4在急性肝衰竭中的作用尚未見報道，鑒于LXA4在炎癥中的特殊作用，我們設計了本實驗。使用D氨基半乳糖（D-GalN）聯合脂多糖（LPS）對大鼠腹腔注射建立急性肝衰竭模型，觀察LXA4對大鼠急性肝衰竭的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

LXA4購自Cayman，D-氨基半乳糖（D-GalN）購自Biosharp，Percoll分離液購自武漢谷歌生物，IV型膠原酶購自Biosharp，其余試劑無特殊說明均購自Sigma。

1.2 建立動物模型

雄性SPF級Wister大鼠33只，體重在170～230 g之間，購自湖北省實驗動物研究中心，編號syxk（鄂）2003-0014。所有大鼠隨機分為正常組、模型組、脂氧素組小、中、大劑量組、PDTC組共6組。正常組3只，其余各組均為6只，分別用

苦味酸溶液做好標記。模型組先給大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖300 mg/kg，半小時后在不同部位腹腔注射脂多糖50μg/kg；脂氧素小、中、大劑量組先分別給大鼠腹腔注射脂氧素A4 0.5、1、2μg/kg，半小時后在不同部位腹腔注射D-氨基半乳糖300 mg/kg和脂多糖50μg/kg；PDTC組大鼠先腹腔注射PDTC 100 mg/kg及D-氨基半乳糖，半小時后腹腔注射D-氨基半乳糖300 mg/kg和脂多糖50μg/kg。所有大鼠均在給藥處理24 h后處死。

1.3 肝組織病理檢測

實驗大鼠肝臟采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、制成切片后采用HE染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟的病理損傷情況。采用400倍鏡頭觀察，隨機選取5個視野。結果判定：0級，無或僅有少許損傷；1級，輕度損傷，細胞腫脹，局限細胞出現核固縮；2級，中度損傷，廣泛核固縮，胞漿嗜酸性染色增強，出現橋接壞死；3級，嚴重壞死，肝索消失，出血，大量炎癥細胞浸潤。

1.4 各項指標檢測

ALT，AST活性檢測，血清分離后立即在自動生化儀上檢測。血清TNF-α及IL-6檢測，血清TNF-α及IL-6檢測試劑盒購自RD公司，按說明書進行。肝組織TNF-αmRNA及IL-6 mRNA檢測，采用Realtime-PCR，實時PCR所用試

劑為SYBR qPCR mix（TOYOBO）。

1.5 肝組織Caspase3活性檢測

應用商品化試劑盒（碧云天），嚴格按照說明書操作。

1.6 統計學處理

使用SPSS13.0統計學軟件，所有計量資料均以（）表示，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能情況

模型組大鼠谷丙轉氨酶（ALT）及谷草轉氨酶（AST）均明顯升高，脂氧素小中大劑量組ALT、AST均較模型組降低（P<0.05）。PDTC組ALT、AST的升高程度與脂氧素大劑量組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

注：與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與PDTC組比較，▲P<0.05VT

2.2 各組大鼠肝臟病理切片情況

模型組大鼠的肝細胞變性壞死和匯管區炎癥明顯（圖1），脂氧素小中大劑量組和PDTC組大鼠的肝細胞變性及壞死較模型組明顯減輕（P<0.05），PDTC組肝臟炎癥評分與脂氧素大劑量組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠血清IL-6、TNF-a情況

模型組大鼠的IL-6、TNF-a水平較正常組明顯升高，脂

氧素小中大劑量組和PDTC組大鼠的IL-6、TNF-a水平較模型組明顯下降（P<0.05）。PDTC組大鼠的IL-6、TNF-a水平與脂氧素大劑量組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 肝組織TNF-αmRNA及IL-6mRNA表達（RealTime-PCR）

模型組大鼠肝組織TNF-α mRNA及IL-6mRNA表達明顯升高，與正常組相比，P<0.05。脂氧素各組與PDTC組大鼠肝組織TNF-α mRNA及IL-6mRNA表達量較模型組明顯下降（P<0.05）。脂氧素大劑量組與PDTC相比，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.5 各組大鼠肝組織Caspase3活性檢測結果

模型組大鼠肝組織Caspase3活性明顯升高，與正常組相比，P<0.05。脂氧素各組與PDTC組大鼠肝組織Caspase3活性較模型組明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。脂氧素大劑量組與PDTC相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

D-氨基半乳糖和脂多糖聯合使用能夠造成特異性的肝損傷，在實驗中經常被用來制作急性肝衰竭動物模型[2]。在此次實驗中急性肝衰竭模型大鼠顯示肝臟轉氨酶活性明顯

增高，AST超過8000 U/L，肝臟病理檢查發現肝臟結構紊亂，存在嚴重的炎癥壞死及出血，且模型組大鼠死亡率達到50%，說明我們造模是成功的。

本研究中發現給予大鼠注射脂氧素A4能明顯減輕D-氨基半乳糖和脂多糖聯合造成的急性肝損傷，肝功能上可以降低大鼠血清ALT、AST水平，組織學上表現為能夠明顯降低肝組織的炎癥壞死，提高存活率。證實了LXA4具有保護肝組織的作用。

有文獻報道，TNF-α的誘導作用是已知的肝臟炎癥反應中最早起作用的因素之一，它可以引發其他細胞因子的循環炎級聯反應，使得肝細胞壞死和觸發炎癥消退反應[3]。在不同的微環境下TNF-α能夠誘導肝細胞增殖同時也可以促進肝細胞的凋亡或壞死[2]。TNF-α通過激活肝細胞的NF-κB來抗凋亡，通過活化caspases來促進凋亡或壞死[4]。已有文獻報道，急慢性乙肝患者和丙肝患者的血清及肝組織中TNF-α水平都較正常人有升高，急性肝衰竭患者血清中TNF-α含量升高非常明顯[5]。TNFR1缺失的小鼠能夠完全抵御D-氨基半乳糖和脂多糖聯合給藥造成的致死性肝損傷，說明TNF在此模型中起到核心作用[6]。在本研究中，脂氧素能夠明顯降低急性肝衰竭時血清TNF-α及肝組織TNF-αmRNA水平，證實其保肝作用與此有關。

在肝臟，Kupffer細胞和肝細胞分泌IL-6[7]，在肝臟發生急性炎癥時可以誘導肝臟生成急性期蛋白，急性期蛋白在急性肝炎患者血清中的含量和患者疾病的嚴重程度呈正相關[8]。如果阻斷小鼠肝細胞IL-6的信號通路，IL-6對脂多糖誘導的肝衰竭敏感性增加[9]。本研究顯示脂氧素能夠明顯減少急性肝衰竭時血清中IL-6及肝組織IL-6 mRNA水平。在肝臟內TNF-α及IL-6主要是由Kupffer細胞產生[10]。特異性的抑制Kupffer細胞NF-κB激活可以阻斷脂多糖誘導的TNF-α產生，進而抑制肝細胞的死亡。最近的文獻也報道，抑制Kupffer細胞NF-κB活化能夠減少致炎細胞因子的產生，能夠改善D-GlaN/LPS誘導肝衰竭大鼠肝損傷并提高存活率，并且對肝組織中的抗凋亡蛋白沒有影響[11]。既然如此，那么脂氧素對肝臟的保護作用是否是通過抑制Kupffer細胞NF-κB的活性來發揮作用呢？需要我們更深入的研究。

有文獻報道PDTC處理可以顯著保護硫代乙酰胺引起的急性肝衰竭[12]。本研究顯示，脂氧素對急性肝衰竭大鼠的保護作用優于PDTC，提示脂氧素對肝衰竭的保護作用還存在其他的保護途徑。LXA4能夠降低D-GlaN/LPS誘導肝衰竭大鼠血清中的TNF-α和IL-6水平，減輕肝細胞的凋亡和壞死經過LXA4預處理的大鼠各項指標優于PDTC組，說明LXA4對急性肝衰竭大鼠的保護作用是通過多種機制實現的。具體的保護機制需要進一步更完善的研究來揭示，這也是我們今后的工作目標。

[參考文獻]

[1] El Kebir D，József L，Filep JG. Opposing regulation of neutrophil apoptosis through the formyl peptide receptor-like 1/lipoxin A4 receptor： implications for resolution of inflammation[J].J Leukoc Biol，2008，84（3）：600-606.

[2] Jin S，Wang XT，Liu L. P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein 2 are oppositely altered in brain of rats with thioacetamide-induced acute liver failure[J].Liver Int，2013，33（2）：274-282.

[3] Mochizuki S，Morishita H，Sakurai K.Macrophage specific delivery of TNF-α siRNA complexed with β-1，3-glucan inhibits LPS-induced cytokine production in a murine acute hepatitis model[J].Bioorg Med Chem， 2013，21（9）：2535-2542.

[4] Abramson A，Menter A，Perrillo R.Psoriasis，hepatitis B，and the tumor necrosis factor-alpha inhibitory agents：a review and recommendations for managementMacrophage specific delivery of TNF-α siRNA complexed with β-1，3-glucan inhibits LPS-induced cytokine production in a murine acute hepatitis mode[J].J Am Acad Dermatol，2012，67（6）：1349-1361.

[5] Tacke F，Luedde T，Trautwein C.Inflammatory pathways in liver homeostasis and liver injury[J].Clin Rev Allergy Immunol，2009，36（1）：4-12.

[6] González-Terán B，Cortés JR，Manieri E.Eukaryotic elongation factor 2 controls TNF-α translation in LPS-induced hepatitis[J].J Clin Invest，2013，123（1）：164-178.

[7] Kuhn A，Weiler-Normann C，Schramm C. Acute liver failure following minocycline treatment - a case report and review of the literature[J].Z Gastroenterol，2012，50（8）：771-775.

[8] Jin SW， Zhang L，Lian QQ，et al.Posttreatment with aspirin-triggered lipoxin A4 analog attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice： the role of heme oxygenase-1[J]. Anesth Analg，2007，104（2）：369-377.

[9] Meng F，Wang K，Aoyama T.Interleukin-17 signaling in inflammatory， Kupffer cells， and hepatic stellate cells exacerbates liver fibrosis in mice[J].Gastroenterology，2012，143（3）：765-776.

[10] Hoffmann F，Sass G，Zillies J，et al.A novel technique for selective NF-kappaB inhibition in Kupffer cells： contrary effects in fulminant hepatitis and ischaemia-reperfusion[J].Gut，2009，58（12）：1670-1678.

[11] Lu JW，Wang H，Yan-Li J. Differential effects of pyrrolidine dithiocarbamate on TNF-alpha-mediated liver injury in two different models of fulminant hepatitis[J].J Hepatol，2008，48（3）：442-452.

（收稿日期：2013-03-04）