SLIT2與CXCR4在乳腺癌的表達及意義

[摘要] 目的 檢測SLIT2與CXCR4在乳腺癌中的表達情況，并進一步探討SLIT2與CXCR4之間關系。 方法 應用免疫組化法檢測217例浸潤性乳腺癌和20例正常乳腺組織標本中SLIT2和CXCR4蛋白的表達情況。 結果SLIT2在正常乳腺組織表達高于乳腺癌，SLIT2與ER、PR表達呈正相關；CXCR4在乳腺癌中高表達，與HER2表達呈正相關，SLIT2與CXCR4 的表達呈負相關。 結論 SLIT2和CXCR4蛋白與浸潤性乳腺癌的發生發展存在一定相關性，檢測二者的表達對浸潤性乳腺癌治療及判斷預后提供理論依據。

[關鍵詞] 乳腺癌；SLIT2；CXCR4

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）07-143-03

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升并呈現低齡化趨勢，對女性健康構成了極大威脅[1]，從20世紀90年代起，中國發達地區乳腺癌發病率呈上升狀態，并逐步升至女性惡性腫瘤的首位。尋找乳腺癌新的生物學指標一直是人們的研究熱點。SLIT是一種由神經膠質細胞分泌的細胞外基質蛋白，在體內對神經元軸突的生長進行導向，在體外與感覺軸突側支發芽和生長有關。哺乳動物體內的SLIT包含3種亞型即SLIT1、SLIT2、SLIT3 ，SLIT1主要神經系統表達，而后二者除神經系統外，在人體內多種組織都有所表達[2]。CXCR4 是一個編碼352個氨基酸的 G蛋白偶聯受體，與趨化因子 CXCL12（SDF-1） 相互作用，構成了CXCR4/SDF1生物學軸介導細胞遷移與信息傳遞。目前SLIT2與CXCR4蛋白在乳腺癌組織中的表達情況了解甚少，其與乳腺癌臨床病理參數之間的關系也尚不完全清楚。本實驗應用免疫組化方法檢測SLIT2、CXCR4在乳腺癌、乳腺正常組織表達情況，進而探討分析其與腫瘤發生發展及臨床病理特征間關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

237例乳腺組織取自中國醫科大學附屬第一臨床醫院，為2001～2009年手術切除標本，其中乳腺正常組織20例，乳腺浸潤性癌病變組織217例。乳腺浸潤性癌按照ER（+）PR（+）、ER（-）PR（-）和HER2的陰陽性分為4組。

1.2 試劑

兔抗人單克隆anti-SLIT2抗體（武漢博士德公司），兔抗人CXCR4多克隆抗體（ab2074）購自abcam公司，PV9000二步法免疫組化檢測試劑及DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學PV-9000兩步法。4 μm連續切片，切片常規脫蠟至水后。將切片浸入沸騰后pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，高溫高壓進行抗原修復后，自然冷卻，PBS液沖洗2 min×3次。置于3% H2O2內15 min滅活內源性過氧化物酶，PBS液沖洗2 min×3次。滴加一抗（SLIT2及CXCR4稀釋比例均為1︰100），4℃冰箱過夜；PBS液沖洗2 min×3次，滴加PV-9000二步法檢測試劑盒的試劑1，37℃溫箱內孵育25 min；PBS液沖洗2 min×3次，滴加PV-9000二步法檢測試劑盒的試劑2，37℃溫箱內孵育30 min；PBS液沖洗3 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木精復染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。每批均設已知陽性切片作對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

SLIT2蛋白主要定位于胞漿，CXCR4蛋白定位于胞核和（或）胞漿，均以出現清晰棕黃色顆粒為準。對每張切片隨機選取5個高倍視野，按染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色3分；按陽性細胞數所占百分比評分：陰性為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；

最后按兩者乘積分數評分，分數≥3為陽性，<3分為陰性。

1.5 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析。各組間率的比較使用x2 檢驗或校正的x2 檢驗，SLIT2與CXCR4蛋白的相關性分析用非參數Spearman等級相關分析法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLIT2和CXCR4蛋白在浸潤性乳腺癌及乳腺正常組織中的表達 （表1）

2.2 SLIT2 和CXCR4 蛋白表達與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關系

SLIT2在正常乳腺組織表達（70.0%）高于乳腺癌（28.57%），差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。SLIT2表達在ER（+） PR（+）組高于ER（- ）PR（-）組，兩者差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。SLIT2與ER、 PR表達呈正相關。SLIT2與HER2表達無相關性（P>0.05）（表3）。ER（-）PR（-） 組內及ER（+）PR（+）組內，SLIT2表達在HER2（-）組均高于HER2（+）組，但差異均無統計學意義（P>0.05）。見表4～5。CXCR4在乳腺癌中表達（67.74%）高于正常乳腺組織表達，兩者差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。ER（-）PR（-）組中的CXCR4表達（70.47%）高于ER（+）PR（+）組（65.17%），但差異無統計學意義，（P>0.05）。見表2。在總HER2（+）組的CXCR4表達高于總HER2（-）組，且在ER（-）PR（-）組內及在ER（+）PR（+）組內，HER2（+）組中CXCR4的表達均高于HER2（-）組中的表達，差異均有統計學意義，CXCR4與HER2正相關（P<0.05）。見表3～5。

2.3 SLIT2和CXCR4蛋白在浸潤性乳腺癌中表達的相關性

在乳腺癌組中62例SLIT2蛋白表達陽性病例中，21例CXCR4蛋白表達陽性，155例SLIT2蛋白陰性病例中，29例CXCR4表達陰性。經Sperman相關分析顯示，乳腺癌中SLIT2與CXCR4 蛋白的表達呈負相關（r =-0.458，P<0.01） 。

乳腺癌組中CXCR4核及漿表達，乳腺癌組中SLIT2漿表達見圖1～2。

3 討論

Slits 基因編碼一組相對分子質量為（170～190）×103 的分泌型蛋白質， 目前克隆的有Slit1、Slit2以及SLIT3。SLIT2是近年來發現的一個新的腫瘤抑制因子，該基因位于位于4P15.2。已有實驗證實該基因有抑瘤活性。該蛋白在多種腫瘤組織中表達下調，如肺癌[3]，膠質瘤[4]等。

本實驗采用免疫組化方法檢測SLIT2蛋白在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達情況，結果顯示SLIT2蛋白在乳腺癌組織中的表達水平低于正常乳腺組織，提示該蛋白表達缺失可能和乳腺癌的發生有關。并且本實驗結果顯示Slit2與ER、PR表達呈正相關，提示Slit2可能與乳腺癌發展及預后有關。Kim等[5]研究發現，乳腺癌組織中SLIT2基因甲基化頻率明顯高于正常乳腺組織，提示腫瘤組織中SLIT2基因發生甲基化從而使其表達降低。

CXCR4 基因位于染色體2q21，編碼蛋白質含352個氨基酸，主要參與信號轉導并與趨化因子 CXCL12（SDF-1） 相互作用， 構成了CXCR4/SDF1生物學軸介導細胞遷移與信息傳遞。該基因編碼的蛋白質在人體組織中廣泛存在，并與腫瘤的發生發展密切相關，在多種腫瘤組織中呈現高表達，如膽囊癌[6]，結腸癌[7]等。本實驗研究發現CXCR4基因所編碼的蛋白在乳腺癌組織的中的表達水平顯著高于正常乳腺組織，且與HER2表達正相關，提示CXCR4的高表達是乳腺癌發生發展過程中重要的促進因素。Muller等[8]研究表明，乳腺腫瘤細胞較正常乳腺細胞的CXCR4表達明顯增高，推測乳腺腫瘤細胞中的CXCR4與其相應的配體結合后可促進乳腺上皮細胞癌變，從而導致腫瘤細胞趨化和侵襲。

SLIT2作為一種有效的化學誘導物，參與調解Slit/Robo信號通路；此外，SLIT也可通過影響CXCR4所介導的信號通路的下游分子，進而調解CXCR4的表達[9]。Marlow等[10]研究發現，SLIT的過表達可以使CXCR4表達水平降低，從而抑制腫瘤細胞生長。本實驗研究結果乳腺癌組織中SLIT2與CXCR4蛋白的表達成負相關，提示兩者共同參與了乳腺癌的發展進程。因此，進一步探索Slit2和CXCR4在乳腺癌細胞中的信號傳導機制，將有望為乳腺癌靶向治療提供新的思路與策略。

[參考文獻]

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[3] Tseng RC， Lee SH， Hsu HS，et al .SLIT2 attenuation during lung cancer progression deregulates beta-catenin and E-cadherin and associates with poor prognosis[J].Cancer Res，2010，70（2）：543-551.

[4] Yiin JJ，Hu B，Jarzynka MJ，et al.Slit2 inhibits glioma cell invasion in the brain by suppression of Cdc42 activity[J].Neuro Oncol，2009，11（6）：779-789.

[5] Kim GE，Lee KH，Choi YD，et al.Detection of Slit2 promoter hypermethylation in tissue and serum samples from breast cancer patients[J].Virchows Arch，2011，459（4）：383-390.

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[9] Prasad A，Femandis AZ，Rao Y，et al.Slit protein-mediated inhibition of CXCR4-induced chemotactic and chemoinvasive signaling pathways in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2004，279（10）：9115-9124.

[10] Marlow R，Strickland P，Lee JS，et al.SLITs suppress tumor growth in vivo by silencing Sdf1/Cxcr4 within breast epithelium[J].Cancer Res，2008，68（19）：7819-7827.

（收稿日期：2013-03-11）