蛇床子素與DNA的相互作用研究

[摘要] 用光譜法研究了蛇床子素與脫氧核糖核酸的相互作用，結果表明，在最大發射波長408 nm處，脫氧核糖核酸能顯著地猝滅蛇床子素的熒光信號。在pH=5.5時，信號猝滅的強度△F最大，并且體系的熒光強度與DNA濃度在10～40 nmol/L范圍內呈良好的線性關系。

[關鍵詞] 蛇床子素；脫氧核糖核酸；相互作用

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）07-33-02

近年來，由于天然植物有效成分被廣泛應用于生物制品、藥物等領域[1]，天然植物的活性成分與DNA的相互作用的研究受到了廣泛關注，蛇床子素與DNA結合作用研究還未見到。因此本文采用熒光光譜法，探討了蛇床子素與DNA的相互作用以及最佳條件，這些研究有助于了解蛇床子素在生物體內復雜的相互作用過程，為提高其藥效和設計新藥提供參考價值。

1 實驗部分

1.1 儀器

FLS 920熒光光譜儀（英國Edingburgh公司）；pHS-3B型精密酸度計（上海雷磁儀器）；BT25S電子分析天平（Sartorius公司）。

1.2 試劑

5.0×10-3 mol/L蛇床子素儲備液：準確稱取1.22 mg蛇床子素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110822-200407），用乙醇溶解并定容至1 mL，渦旋溶解即得。用時再用乙醇稀釋至所需濃度。

50 mmol/L MES緩沖液：稱取0.533 g MES，溶于40 mL蒸餾水中，用NaOH調節溶液的pH值至5.5，最后加蒸餾水定容至50 mL即可。所用試劑均為分析純，實驗用水均為Millipore Milli-Q系統凈化的超純水。

DNA序列：5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3’；DNA溶液的配制：按說明書加適量緩沖稀釋成100 μmol/L的儲備液，用時再用緩沖稀釋至所需濃度，保存在4℃冰箱中備用。

1.3 熒光光譜的測定

準確移取1.0×10-3 mol/L的蛇床子素溶液10 μL于400 μL比色皿中，加入MES緩沖溶液適量（控制溶液總體積為200 μL），掃描其熒光光譜后，再分別加入一定體積的濃度為100 nmol/L的DNA溶液，混合均勻并靜置30 min，于340 nm為激發波長，408 nm為發射波長，激發和發射狹縫都是3 nm條件下，測定熒光強度F值。

2 結果與討論

2.1 光譜特征

蛇床子素、DNA和蛇床子素-DNA復合物的激發和發射光譜分別如圖1和圖2所示。由發射光譜圖可以看出，DNA的熒光信號很弱，蛇床子素的熒光信號最強，當加入DNA后，體系的熒光信號強度明顯減弱，可見DNA對蛇床子素的熒光具有猝滅作用。結果表明蛇床子素與DNA之間發生了較強的相互作用。

.2 酸度與緩沖溶液的影響

考查了緩沖溶液的類型和pH值對熒光信號猝滅程度的影響。分別用Tris-HCl，PBS和MES 3種緩沖進行了試驗，結果表明，在MES緩沖溶液中猝滅效果最為顯著，并且當pH=5.5時加入DNA前后的△F達到最大值。因此選用pH=5.5的MES緩沖溶液作為本實驗的最佳緩沖溶液。

2.3 離子強度與鹽效應的影響

通過向體系中加入不同量的NaCl來考查離子強度和鹽效應對體系的影響。當NaCl的濃度在<10 mmol/L的情況下，體系的熒光強度沒有明顯的影響。

2.4 DNA變性實驗

將DNA在100℃的沸水中煮20 min后，立即拿出放入冰水中冷卻后，再將其加入蛇床子素的熒光體系中，發現此時熒光信號未降低，即變性后的DNA不能猝滅蛇床子素的熒光強度。

2.5 線性范圍

將蛇床子素的濃度固定為1.0×10-3 mol/L，取樣量為10 μL，改變DNA的濃度，分別測得熒光強度。熒光光譜如圖3所示。結果表明：在最佳條件下，體系的熒光強度與DNA的濃度在10～40 nmol/L范圍內呈線性關系。線性方程為：y=-798.99x+72 856，R2=0.9942，檢測限為1.2 nmol/L。

3 結論

蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚（Osthole），其化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高的一種烴基香豆素類有效化學成分[2]。現代藥理實驗研究表明蛇床子素具有抗高血脂[3]、抗心律失常[4]、抗衰老[5]、抗腫瘤[6-7]、抗骨質疏松癥[8]、抗炎及抗變態反應[9-11]等功效。周俊等[12]研究發現，蛇床子素對肺鱗癌和肺腺癌的瘤體生長有一定的抑制作用。

脫氧核糖核酸（DNA）是人體內一類重要的遺傳物質，是抗腫瘤藥物作用的重要靶點之一。許多分子能與DNA分子發生相互作用，進而影響DNA的復制，因此研究小分子與DNA的作用，對于從分子水平上了解抗癌藥物作用機理以及以DNA為靶點的藥物分子設計具有重要意義[13-14]。

從本研究結果可以看出，蛇床子素與DNA之間有著較強的的相互作用，這種結合作用導致了體系熒光強度的猝滅，并且經過優化，發現這種猝滅的效果在pH=5.5的MES緩沖溶液中表現較為顯著，同時體系在鹽濃度<10 mmol/L的情況下影響不大；在最佳條件下，體系的熒光強度與DNA的濃度在10～40 nmol/L范圍內呈線性關系。但是具體是靜態猝滅還是動態猝滅，以及這種相互作用的方式是吸附還是嵌入都還有待進一步研究討論。

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（收稿日期：2013-03-19）