α-硫辛酸對2 型糖尿病大鼠肝臟氧化應激和內質網應激的影響

李靜，李瑞芳，王國賢，李云

(1.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧 錦州121001;2.邯鄲市中醫院腦外科，河北 邯鄲056001)

我國2 型糖尿病的發病率呈上升趨勢，這對人民的健康造成嚴重威脅。糖尿病性肝病是糖尿病的主要并發癥之一，持續高血糖及糖脂代謝紊亂導致脂肪肝、肝纖維化以及炎癥的產生［1]。研究證實，在高脂高糖狀態下機體內氧化、抗氧化系統失去平衡，而抗氧化治療在改善2 型糖尿病及其并發癥方面的應用越來越受到重視。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來發現的介導細胞凋亡的途徑之一，它不同于已知的死亡受體途徑和線粒體途徑。多種因素均可激活內質網應激，諸如高血糖、高血脂、高血壓、氧化應激、腎素-血管緊張素系統激活等因素［2-4]。

本研究通過高脂高糖飲食聯合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)注射的方法建立2 型糖尿病大鼠模型，該模型具有糖脂代謝紊亂、肝臟脂肪變性等特征，再給予α-硫辛酸進行干預治療，并與維生素E比較，探討α-硫辛酸調節糖脂代謝，增加抗氧化能力，改善內質網應激的作用機制以及對肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

α-硫辛酸(美國Sigma 公司)，維生素E(浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠)，鏈脲佐菌素(美國Sigma 公司)，血糖檢測儀(美國強生公司)，空腹血糖、血脂、肝血清酶學(AST、ALT)等指標采用日立7020 全自動生化分析儀，丙二醛(MDA)，SOD，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成科技有限公司)，TUNEL 試劑盒(南京凱基科技有限公司)，兔抗大鼠多克隆C-Jun 氨基端激酶(c Jun NH2-terminal kinase，JNK)抗體(Sant Cruz 公司);兔抗大鼠單克隆p-JNK 抗體(Cell Signaling 公司)，SD 大鼠和飼料由遼寧醫學院實驗動物中心提供。

1.2 糖尿病模型的建立與分組

健康雄性SD 大鼠50 只，體質量150 ～200 g，隨機分為兩組。對照組10 只給予普通飼料飲食(碳水化合物60% +蛋白質20% +脂肪10% +纖維素等其他成分10%)，實驗組40 只給予高脂飼料(基礎飼料79% + 膽固醇1% + 蛋黃酚10% + 豬油10%)喂養。1 個月后對實驗組大鼠空腹12 h，腹腔注射小劑量STZ 35 mg/kg，72 h 后尾靜脈取血測定血糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L 為造模成功，將造模成功的30 只大鼠隨機平均分為糖尿病模型組、α-硫辛酸組、維生素E 組。α-硫辛酸組給予60 mg/kg α-硫辛酸，維生素E 組給予20 mg/kg 維生素E，灌胃12 周;對照組和糖尿病組不予任何處理。

1.3 標本收集

實驗結束時，腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，經頸總動脈收集血標本，保存在-20℃待測空腹血糖、血脂、AST、ALT 等指標。迅速取出肝組織，配成10%的勻漿，分離血清，測量肝臟組織中MDA、SOD、GSH-Px 的活性。并迅速將肝組織分解，一部分-80℃凍存，待測蛋白質印跡，另一部分常規包埋蠟塊待測TUNEL。

1.4 TUNEL 檢測細胞凋亡指數

切片常規脫蠟水化，按試劑盒說明進行肝組織切片細胞凋亡的原位檢測。鏡下觀察，隨機選取5個高倍視野。計算出平均每100 個細胞中的凋亡細胞數，以百分數(% )表示凋亡指數(apoptotic index，AI)。

1.5 蛋白質印跡法檢測JNK 蛋白含量

取-80 ℃凍存肝標本100 mg 加入裂解液中剪碎后移入1.5 mL 環氧樹脂管中，高速離心，取上清液用于蛋白定量。SDS-PAGE 電泳，半干轉法將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，恒壓電泳，室溫封閉4 h，按0.1 mL/cm2膜面積加入一抗(p-JNK 抗體稀釋度1 ∶900，JNK 抗體稀釋度1 ∶1000)，雜交2 h，封閉液漂洗后按0.1 mL/cm2膜面積加入二抗，室溫下搖床雜交1 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2 ～5 min，條帶出現，終止反應。以β-肌動蛋白作為內參，進行灰度分析，以灰度比值表示各組表達強度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計軟件分析，計量數據均采用(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖、血脂及肝臟轉氨酶的比較

與對照組比較，糖尿病模型組大鼠血糖、血脂和轉氨酶明顯增高(P均＜0.05)。與糖尿病模型組比較，各給藥組肝臟AST、ALT 和血TG 水平降低(P＜0.05);α-硫辛酸組血糖、TG 明顯下降，但血TC 無明顯變化。見表1。

表1 各組大鼠血糖、血脂及肝功能的比較±s，n=10Tab 1 Comparisons of the fasting glucose，blood lipid and liver function index among each group

表1 各組大鼠血糖、血脂及肝功能的比較±s，n=10Tab 1 Comparisons of the fasting glucose，blood lipid and liver function index among each group

a:P＜0.05，與對照組比較;b:P＜0.05，與糖尿病組比較;c:P＜0.05，與維生素E 組比較

組別 血糖/mmol·L -1 TG/mmol·L -1 TC/mmol·L -1 AST/U·mL -1 ALT/U·mL -1.25 ±0.15糖尿病模型組 24.35 ±3.64a 2.07 ±0.76a 3.38 ±0.58a 27.10 ±0.78a 35.13 ±0.62a維生素E 組 22.61 ±2.81a 1.82 ±0.62a，b 3.07 ±1.25a，b 26.04 ±0.54a，b 29.54 ±0.36a，b α-硫辛酸組 16.87 ±2.56a，b 1.23 ±0.53a，b，c 3.25 ±1.42a 24.81 ±0.15a，b，c 26.55 ±0.18a，b，c F 值 22.741 9.750 11.743 17.471 14.364 P 值對照組 5.42 ±0.14 0.52 ±0.14 1.57 ±0.12 20.04 ±0.12 17＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 各組大鼠肝組織中丙二醛、SOD、GSH-Px 含量的變化

與正常對照組比較，模型組大鼠MDA 增高，SOD、GSH-Px 顯著降低(tMAD=3.520，tSOD=3.467，tGSH=4.950，P＜0.05)。與模型組比較，各給藥組肝組織SOD 及GSH-Px 活性均明顯增高。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px 含量±s，n=10Tab 2 Comparisons of the hepatic MDA，SOD，GSH-Px level among each group

表2 各組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px 含量±s，n=10Tab 2 Comparisons of the hepatic MDA，SOD，GSH-Px level among each group

a:P＜0.05，與對照組比較;b:P＜0.05，與糖尿病組比較;c:P＜0.05，與維生素E 組比較

組別 MDA/nmol·mg -1 SOD/U·mg -1 GSH-Px/U·mg -1 6.04 ±2.08 45.22 ±6.78 25.36 ±4.48糖尿病模型組 10.90 ±3.38a 34.75 ±6.73a 17.54 ±2.24a維生素E 組 9.72 ±2.36a，b 40.51 ±5.71a，b 20.90 ±2.45a，b α-硫辛酸組 9.45 ±2.13a，b 42.15 ±6.13a，b，c 22.14 ±3.23a，b，c F 值 9.185 23.023 17.043 P 值對照組＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 TUNEL 染色鑒定凋亡細胞

正常細胞為藍紫色，凋亡細胞為棕色。正常對照組大鼠有少量肝細胞發生凋亡，糖尿病組和各給藥組均見凋亡細胞(圖1)。正常對照組凋亡指數為(3.02 ±1.15)%，糖尿病組為(26.34 ±7.33)%，α-硫辛酸組和維生素E 組依次為(11.37 ±3.42)%，(17.69 ±4.25)%。

圖1 TUNEL 檢測肝臟細胞凋亡指數(×400)Fig 1 Assessment of the apoptotic cells on liver by TUNEL staining

2.4 各組肝組織JNK 蛋白的表達

對照組、糖尿病組、α-硫辛酸組、維生素E 組大鼠肝臟組織p-JNK 蛋白表達水平分別為(0. 45 ±0.05)、(0.84 ±0. 28)、(0. 60 ±0. 07)和(0. 76 ±0.35)。與對照組比較，糖尿病組p-JNK 蛋白表達明顯增加(t=4.194，P＜0.01);α-硫辛酸組較模型組明顯下降(t=2.667，P＜0.01);維生素E 組較模型組也明顯下降(t=2. 183，P＜0. 05)。見圖2。比較各組JNK 蛋白表達水平，結果顯示，各組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖2 蛋白質印跡法檢測各組大鼠肝臟p-C-Jun 和C-JNK 蛋白水平Fig 2 Protein expression of p-C-Jun and C-JNK in liver by Western blot

3 討論

近年來，氧化應激狀態在代謝綜合征和糖尿病及其慢性并發癥的發生、發展中的作用日益受到重視。糖尿病性肝病已成為糖尿病的主要并發癥之一［5]。糖尿病的代謝紊亂導致的高血糖、高血脂使細胞內活性氧(ROS)生成增加或清除不足，機體出現氧化應激，從而影響組織細胞的代謝和功能，最終導致組織細胞損傷，激活相關促凋亡基因，導致細胞凋亡［6]。因此，氧化應激是糖尿病的一個危險因子。仔細分析發現，肝細胞的特點及其各種功能障礙，使其容易處于氧化應激狀態，再加上炎癥作用，更加劇了肝損傷。氧化應激不僅是肝功能障礙的一部分，也是所有肝損傷的病理生理基礎［1，7-8]。本實驗中，α-硫辛酸治療12 周，可降低2 型糖尿病大鼠血糖水平和血漿中TC、TG 的水平，一定程度上改善了2 型糖尿病的糖脂代謝紊亂，同時，可使肝臟組織中MDA 含量顯著降低，SOD、GSH-Px 活性顯著升高，伴隨血清轉氨酶活性的降低，說明α-硫辛酸在一定程度上修復了糖尿病時氧化應激對肝臟的損傷。

ERS 是近年來發現的介導細胞凋亡的途徑之一，它不同于已知的死亡受體途徑和線粒體途徑。適量的內質網應激可保護細胞，但過強或持續時間過長會誘導細胞凋亡。ERS 引起的細胞凋亡有一套自身的信號傳遞通路，稱為ER 相關性死亡(ER-associateddeath，ERAD)途徑。ERAD 途徑包含CHOP/GADD153 表達、JNK 的活化和capase-12 蛋白水解酶的活化［9]。現已發現，許多肝臟疾病的發生發展均與內質網應激及其介導的細胞凋亡有關［8]。高脂高糖飼料聯合STZ 法誘導的2 型糖尿病大鼠出現糖脂代謝紊亂，氧化應激等因素引起ERS產生，通過JNK 信號通路激活凋亡前體蛋白Bax，這種分子可以增加線粒體的通透性，使線粒體釋放細胞色素C，激活胱門蛋白酶-3 和-7，最終導致細胞凋亡［10]。本實驗結果顯示糖尿病大鼠p-JNK 的表達顯著高于正常大鼠，證實糖尿病時存在內質網應激。其p-JNK 表達量明顯增高，細胞凋亡率增加，糖尿病模型組p-JNK 蛋白表達水平和凋亡率明顯高于正常組。這說明JNK 信號通路在2 型糖尿病大鼠肝臟疾病中具有重要作用。

α-硫辛酸被譽為萬能抗氧化劑，具有清除自由基和活性氧的能力［11]。本實驗發現糖尿病模型大鼠存在著明顯的氧化應激和內質網應激，而通過α-硫辛酸可調節糖脂代謝，增加其抗氧化能力，改善其ERS，推測其作用機制可能與其抑制JNK 通路的活化有關。

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