納米抗菌復合膜的結構及作為引導骨組織再生膜的生物相容性研究

劉曼 張強 周立偉 莫安春 李小玉 李吉東

[摘要] 目的 觀察載銀納米羥磷灰石/二氧化鈦/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/PA66）納米抗菌復合膜的物理結構及對成骨樣細胞生物相容性的影響。方法 掃描電鏡（SEM）和光學顯微鏡下觀察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和膨體聚四氟乙烯（e-PTFE）膜的結構，在兩組膜材料上接種成骨樣細胞MG63，另設空白對照組。甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測MG63細胞的增殖曲線，酶聯免疫法檢測細胞內堿性磷酸酶（ALP）的表達，SEM下觀察細胞在生物膜表面的增殖和黏附情況。結果 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜正面疏松多孔，反面光滑致密。e-PTFE膜正反面結構相同，由成行排列的長橢圓形裂隙組成。與空白對照組相比，MTT檢測顯示，兩種膜對MG63細胞增殖活力差異無統計學意義（P>0.05）；ALP活性間差異也無統計學意義（P>0.05）。SEM下觀察細胞在兩種膜上生長良好，在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上細胞伸展更充分。

結論 Ag-nHA-nTiO2/PA66膜對MG63細胞生長無抑制作用。與e-PTFE相比，其具有更優良的結構和生物學性能，適于用作引導骨再生膜材料。

[關鍵詞] 引導骨再生； 羥磷灰石； 銀； 成骨樣細胞MG63

[中圖分類號] R 783.1 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.004

引導骨再生（guided bone regeneration，GBR）生物膜技術在口腔醫學領域中發揮重要的作用。載銀納米羥磷灰石/二氧化鈦/聚酰胺66（Ag-nHA-nTiO2/

PA66）納米抗菌復合膜是將無機納米復合抗菌材料

載銀納米羥磷灰石/納米二氧化鈦（Ag-nHA-nTiO2）和聚酰胺66（PA66）復合，采用“常壓共溶法”制備而

成的。在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜中的nTiO2和Ag+含量分別為0.48%和2.35%。前期實驗已證實其對口腔常見細菌具有良好的抗菌性[1]。但是，對于該膜的結構及生物相容性尚缺乏研究。因此，本實驗以膨體聚四氟乙烯（e-polytetra fluoroethylene，e-PTFE）膜為對照，通過光鏡和掃描電鏡（scanning electron mi-

croscope，SEM）對比觀察Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌

膜的結構，并在兩種膜上接種成骨樣細胞株MG63，觀察MG63在膜上的生物學活動變化，探討Ag-nHA-nTiO2/PA66膜作為GBR膜的生物相容性。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

e-PTFE膜（上海塑料研究所第一研究室），Ag-

nHA-nTiO2/PA66膜（四川大學納米生物材料中心），

SEM（JSM-5900，JEOL公司，日本），IX70倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）等。

1.2 膜材料結構觀察

將Ag-nHA-nTiO2/PA66膜和e-PTFE膜剪裁成

1 cm×1 cm方片，制作石蠟切片，厚5 μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，倒置顯微鏡觀

察膜橫截面的結構。取兩種膜材料裁成同樣大小，真空干燥，噴金，采用SEM觀察膜的表面情況。

1.3 膜上成骨樣細胞生長曲線的測定

將e-PTFE膜和Ag-nHA-nTiO2/PA66膜剪裁成直徑為14 mm的圓片各12張，消毒后PBS液清洗3次，置于24孔培養板內，另設空白對照組。按照細胞密度為每孔3×104個進行接種，標準環境下進行孵育（37 ℃，95%空氣，5%CO2），分別于1、3、5、7 d各取出3孔，用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetra-

zolium，MTT）法，在570 nm波長下測定每孔的光密度（optical density，OD）值，每組每次取得3孔的數

值，計算各組平均值，采用雙因素方差法分析結果。

1.4 細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活

性測定

將e-PTFE膜和Ag-nHA-nTiO2/PA66膜剪裁成直徑為34 mm的圓片各12張，消毒后PBS液清洗3次，置于6孔培養板內，另設空白對照組。培養板內按照細胞密度為每孔6×105個接種MG63，標準環境（37 ℃，95%空氣，5%CO2）下進行培養，分別于1、3、5、7 d各取出3孔，收集細胞，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔OD值，測定細胞內ALP活力。

1.5 細胞黏附和增殖情況

細胞培養同1.4。分別于1、5 d取出膜片各3個，3%戊二醛固定，梯度脫水，醋酸異戊酯浸泡20 min。臨界點干燥，噴金，SEM下進行觀察。

2 結果

2.1 膜材料結構觀察結果

2.1.1 倒置顯微鏡下觀察結果 HE染色后e-PTFE膜的橫截面結構比較均勻一致，正、反面都可見較長的裂隙，約30～50 μm，裂隙之間相互交通。正、反面都比較平滑，孔隙大小約為15 μm（圖1左）。Ag-

nHA-nTiO2/PA66膜的橫截面可見大小不等、形狀各異的孔隙相互連通。正面結構疏松，孔隙大小約50～300 μm，從正面到反面的橫截面中可見到300 μm的大孔隙；反面約有50 μm的孔隙，十分致密（圖1右）。

2.1.2 SEM下觀察結果 e-PTFE膜可見成行排列、直徑不一的長橢圓形裂隙，長約5～20 μm，寬約3 μm，正、反面結構基本一致（圖2）。Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜的正面疏松多孔，由大小不等的孔隙構成，孔隙大小從幾微米到上百微米不等，孔隙的形狀各異，大孔隙之間相互通連，其中又有許多小的孔隙，有的孔隙中可見到一些顆粒狀的沉積物。反面比較平滑，孔隙的大小為1～10 μm，孔隙形狀多為圓形，孔隙之間未見交通（圖3）。

Fig 3 Surfaces of Ag-nHA-nTiO2/PA66 membrane SEM × 2 000

2.2 MG63細胞在兩種膜上的生長情況

2.2.1 細胞增殖曲線的測定 分別在1、3、5、7 d測定兩種膜組和空白對照組的OD值，計算其相對時間點上的均值，繪制細胞增殖曲線（圖4）。統計學分

析表明，3組細胞增殖量組間差異無統計學意義（P>0.05），每組在時間點上的數據兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），第1天到第7天逐步增高。

2.2.2 細胞ALP活性的測定 將收集的細胞反復凍融2次后，測定3組不同時段的ALP活性。隨著時間的增加，每組ALP活性均有所增加。統計學分析表明，每組細胞ALP活性第3天與第5天間差異無統計學意義，其余各時間點差異均有統計學意義（P<0.05）。而3組間的ALP活力差異無統計學意義（P>0.05）（圖5）。

2.3 細胞在膜上黏附和增殖的SEM觀察

2.3.1 細胞在e-PTFE膜上的黏附和增殖情況 膜上接種MG63細胞第1天，SEM下觀察到細胞零星的分散在膜上，細胞呈長梭形，偽足伸展長短不一，胞核清楚，胞漿豐富（圖6左）。膜上接種MG63細胞第5天，SEM下觀察到細胞呈片狀分布在膜上不同的區域，多個細胞相互交聯，細胞生長良好，細胞偽足伸展不充分，未見細胞伸入到空隙中（圖6右）。

2.3.2 細胞在Ag-nHA-nTiO2/PA66膜上的黏附和增殖情況 膜上接種MG63細胞第1天，SEM下觀察到細胞黏附在孔隙的邊緣和中間，形態有長梭形，偽足伸展良好，細胞形態多樣，細胞伸出的偽足黏附在孔隙的表面和孔隙中（圖7左）。

接種MG63細胞第5天，SEM下觀察到細胞已經長在膜表面，呈片層狀，細胞有長條形、梭形，形態各異。有的細胞兩端跨越孔隙，有的黏附在孔隙的邊緣，細胞生長良好，細胞相互交通（圖7右）。

3 討論

1982年Nyman等[2]在牙周病的治療中提出引導性組織再生（guided tissue regeneration，GTR）。其基

本原理是：不同組織細胞向創口內生長或遷移速度不同，局部植入人工生物引導膜，利用膜屏障建立一個能使生物再生功能得到最大程度發揮的有利環境[2]。骨組織是以再生方式完成損傷修復的少數組織

之一，GTR概念同樣適用于骨再生過程即GBR。目前，GBR技術已廣泛應用于口腔種植修復領域。

在GBR的操作以及后期使用中經常出現膜暴露、創口感染等問題，嚴重影響GBR成功率[3]，開發具備

抗菌性能的GBR膜尤為重要。但是，很多材料在抗菌的同時也會對正常組織細胞造成抑制甚至造成正常細胞死亡。因此，在探討膜的抗菌性能時，更為重要的是確認膜的生物相容性。本實驗中使用的抗菌Ag+即是廣泛被用作抗菌作用的有效成分，筆者的前期研究也證實Ag-nHA-nTiO2/PA66具有良好的抗菌性能，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為50.10%和56.31%，而對牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌和具核梭桿菌的抗菌率分別為91.84%、90.49%和90.64%[1]。這同其他研究結果類似，即Ag+具有一定的抗菌性能[4]。但是既往研究同時表明：當Ag+濃度較高時對真核細胞會產生毒性，從而抑制細胞活力[5]。Chung等[6]對Ag+的生物相容性進行檢測，發現Ag+對細胞的活力有抑制作用。本實驗抗菌復合膜中起抗菌作用的主要成分也是Ag+。因此，本實驗對新開發的Ag-nHA-nTiO2/PA66復合膜進行了生物相容性方面的研究。結果顯示，對比e-PTFE膜，載Ag+復合膜上，MG63細胞伸展良好，細胞偽足深入空隙且互有交通。細胞增殖曲線顯示細胞增殖活性不受抑制。ALP檢測結果顯示細胞功能良好，成骨能力未受Ag+的影響。由此可見，抗菌復合膜Ag+濃度適宜，不會抑制細胞生長。說明Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜生物相容性良好。

體外細胞復合培養法簡便、敏感、重復性好，已經成為評價生物材料相容性的重要手段[7]。成骨細

胞是一種特殊的成纖維細胞，在骨改建中具有關鍵性作用，成為骨代謝研究中的重要部分。采用體外培養的人成骨細胞可評價材料的生物相容性，并且準確的反映材料對機體的影響。本研究選用的成骨樣細胞株MG63具有多次傳代后仍能保持穩定細胞表型的特性；同時成骨樣細胞株與普通成骨細胞表型接近，在很多成骨相關的研究中都采納成骨樣細胞株作為研究對象[8]。本實驗選擇成骨樣細胞株MG63

作為研究對象，由SEM及ALP表達情況來看，細胞生物學形態及功能表達良好，說明實驗中MG63性狀和表達穩定，實驗結果可靠。

引導膜的結構及其生物相容性在GBR生物膜技術中發揮著關鍵作用。該膜既要允許營養通過，又要求能隔離周圍結締組織細胞長入。既往研究表明：理想的膜支架材料應有較高的孔隙率和孔隙貫通率，以及適于骨組織生長的力學支撐[9]。當孔徑在150 μm以上，則是骨組織長入的理想場所。本實驗中e-PTFE膜結構均一，最大孔徑在20 μm以內；Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜則存在正反面的結構，正面孔徑可達上百微米，而反面孔徑最大不超過10 μm。細胞學實驗可見：e-PTFE膜上細胞可黏附但無深入生長，而Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜上MG63細胞生長良好，且細胞偽足深入孔內。由此說明，相比較e-PTFE膜，Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌膜更具有優勢，其雙層結構在為成骨細胞提供支架的同時，致密一面可以阻止軟組織長入，而疏松的一面則有利于新骨組織的生成。

本實驗通過觀察Ag-nHA-nTiO2/PA66膜的結構以及MG63細胞在其上的生長、表達情況，發現Ag-nHA-nTiO2/PA66膜對MG63細胞的生長無抑制作用，MG63細胞在其組織面上黏附效果好，能夠充分生長和增殖。綜上所述，Ag-nHA-nTiO2/PA66抗菌復合膜具有優良的結構及生物相容性，具有作為GBR膜的可行性。當然Ag-nHA-nTiO2/PA66膜是否能成為優良的GBR膜，還需進一步深入研究。

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（本文采編 石冰）