含銅不銹鋼對血管內皮細胞黏附、增殖及凋亡的影響

徐璐　張揚　楊柯等

[摘要] 目的 觀察含銅不銹鋼對血管內皮細胞黏附、增殖及凋亡的影響，并與316L不銹鋼進行比較。方法 將血管內皮細胞接種于兩種材料表面，在培養1、2、3 d后，應用吖啶橙染色及甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測細胞在兩種材料表面黏附和增殖活性。并制備兩種材料的浸提液，用浸提液培養血管內皮細胞，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果 熒光顯微鏡下，細胞在兩種材料表面均伸展良好，呈鋪路石狀生長。在培養1、2 d時，含銅不銹鋼組黏附的細胞數多于316L不銹鋼組（P<0.05）；3 d時兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。MTT結果顯示，含銅不銹鋼組在1、2 d的吸光度值高于316L不銹鋼組，差異有統計學意義（P<0.05）；而在培養3 d后，兩組間差異無統計學意

義（P>0.05）。316L不銹鋼組的早期凋亡率高于含銅不銹鋼組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 含銅不銹鋼較

316L不銹鋼更利于血管內皮細胞的黏附及增殖，并可以降低血管內皮細胞的早期凋亡率。

[關鍵詞] 含銅不銹鋼； 血管內皮細胞； 黏附； 增殖； 細胞凋亡

[中圖分類號] R 783.5 [文獻標識碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.005 在正畸治療中，支抗控制貫穿于整個治療過程，是治療成敗的重要因素之一[1]。微種植體的支抗作用

是通過種植釘與骨界面的組織學機械鎖結和骨結合，從而抵抗一定限度內的矯治力[2]。在種植體愈合過程

中，新生血管的形成早于成骨活動的開始[3]。血管內皮細胞合成和分泌的調節因子具有調控成骨細胞趨化、增殖及分化的功能[4]。而細胞的生物學行為受生物材料自身性能的影響[5]。因此，不同種植材料很可能會影響種植體-骨界面血管內皮細胞的生物學性狀。中國科學院金屬研究所研發的含銅不銹鋼具有良好的抗菌性能和生物相容性，能有效預防種植體周圍細菌感染的發生[6-7]。本實驗旨在觀察含銅不銹鋼對血管內皮細胞黏附、增殖及凋亡情況的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926由中國醫科大學中心實驗室提供。

1.1.2 實驗材料 316L不銹鋼為醫用級不銹鋼，成分：Cr18%，Ni12%，其余為Fe。含銅不銹鋼（316L-

Cu），成分：Cr18%，Ni12%，Cu4%，其余為Fe，材料由中國科學院金屬研究所提供。

1.1.3 主要試劑和設備 DMEM、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（di-methylsulfoxide，DMSO）、胰蛋白酶（Sigma公司，美國），胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），吖啶橙

（上海化學試劑公司），Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司），熒光倒置顯微鏡（Nikon公司，日本），流式細胞儀（BD公司，美國），

自動酶標檢測儀（Tecan公司，奧地利）。

1.2 方法

1.2.1 試件的制備 將含銅不銹鋼和316L不銹鋼制備成兩種規格試件。一種為直徑10 mm、厚2 mm，各15片，用于黏附實驗和增殖活性檢測；另一種為直徑25 mm、厚2 mm，各5片，用于制備浸提液。上述材料經超聲清洗、干燥，高溫高壓（33 MPa、121 ℃）滅

菌處理后備用。

1.2.2 浸提液的制備 將直徑25 mm、厚2 mm的兩種不銹鋼材料置于6孔培養板中，按試件表面積與培養液之比為3 cm2·mL-1加入DMEM培養液，置于37 ℃培養箱內，浸泡72 h后收集浸提液。

1.2.3 黏附和增殖活性檢測 將直徑10 mm、厚2 mm的兩種不銹鋼試件置于無菌24孔板中。用0.25%胰蛋白酶消化處于對數生長期的血管內皮細胞，制備成密度為每毫升2×104個的細胞懸液，接種到各材料表面，靜置3 h后，從各孔板側壁緩慢加入DMEM培養基1 mL。標準條件下分別培養1、2、3 d后，將兩種材料各取出2片，PBS沖洗3次，95%乙醇固定10 min，晾干，加入0.1 mg·mL-1吖啶橙染液，0.1 mol·L-1氯化鈣分色。在熒光顯微鏡下觀察細胞在不同材料表面的黏附情況，隨機選取上、下、左、右、中5個視野拍照并計數。用MTT法檢測兩種材料表面血管內皮細胞的增殖活性。在培養1、2、3 d后，分別取出兩種不銹鋼材料各3片，PBS沖洗后，置于一預先加入DMEM培養液的新24孔板內。每孔加入5 mg·mL-1的MTT試劑80 μL，繼續培養4 h后，棄培養基，每孔加入450 μL DMSO，37 ℃下靜置2 h，待藍紫色結晶物徹底溶解后，振蕩10 min。將每孔中的液體按每孔150 μL吸入96孔板中，用酶標儀讀取吸光度值（A值）（波長490 nm），實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將濃度為每毫升2×105個的血管內皮細胞接種于3塊6孔板中，分別設計為含銅不銹鋼組、316L不銹鋼組和對照組。培養24 h后，用浸提液置換孔板中的培養液，對照組用新培養液置換，繼續培養24 h。用0.25%胰酶消化細胞，1 000 r·min-1下離心后重懸，制成單細胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI，避光反應15 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行分析，數據以x±s表示，對黏附在材料表面的細胞數及增殖活性采用t檢驗進行分析，對細胞凋亡率采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察結果

熒光顯微鏡下，細胞呈多角形，鋪路石樣排列（圖1）。在培養1、2 d后，含銅不銹鋼組材料表面黏附的內皮細胞數明顯多于316L不銹鋼組（P<0.05）；而在3 d后兩組材料表面黏附的內皮細胞數量差異不明顯（P>0.05）（圖2）。

2.2 MTT法檢測細胞增殖活性

培養1、2 d時，含銅不銹鋼組A值高于316L不銹鋼組（P<0.05）；而培養3 d時，兩組A值間差異不明顯（P>0.05）（圖3）。

2.3 流式細胞儀檢測結果

各組細胞均以正常細胞為主，凋亡細胞在各組間分布不均。316L不銹鋼組早期凋亡的血管內皮細胞多于含銅不銹鋼組和對照組（圖4）。

2.4 細胞凋亡率的測定

316L不銹鋼組、含銅不銹鋼組、對照組的細胞凋亡率分別為5.23%±0.35%、1.96%±0.18%、1.45%±0.15%。經統計學分析，兩種不銹鋼組與對照組相

比，細胞凋亡率間差異有統計學意義（P<0.05）；兩

種不銹鋼組相比，細胞凋亡率間差異有統計學意義（P<0.05）。

Fig 2 The numbers of endothelial cells on two kinds of materials

surface

Fig 3 Proliferation of endothelial cells on two kinds of materials

surface

3 討論

微種植體支抗在正畸臨床應用中較傳統支抗方式相比，具有穩定、舒適、不依賴于患者配合等優點，提供了一種相對穩定的口內強支抗。目前使用的微種植體材料，一般為純鈦、鈦合金及不銹鋼種植體。鈦的生物相容性較好，骨結合能力強，但其材質較脆，易折斷。不銹鋼與鈦相比，具有良好的延展性和強度，穿透能力強，可抵抗一定程度的旋轉力，降低種植體折斷的風險。但在臨床應用中，種植體周圍炎的發生而導致種植體松動、脫落已成為微種植體失敗的重要原因之一[8]。本實驗中應用的

含銅不銹鋼是一種集結構與功能于一體的新型生物醫用材料。含銅不銹鋼在體內會釋放微量的銅離子，經證明能有效地殺滅引起種植體周圍炎的常見致病菌[7]，因此是一種極具開發潛力的微種植體材料。

種植體植入后起初被凝血塊包繞，隨后成骨細胞分化并參與骨形成[9]。骨形成是骨內微環境中血管

內皮細胞、成骨細胞和破骨細胞之間共同作用的結果[10]。相關研究表明：血管內皮細胞合成的血管發

生因子能促發絲裂原反應，在骨結節的形成中發揮重要作用[11]。同時，血管內皮細胞釋放的內皮素-1

可結合成骨細胞膜上存在的相應受體，從而刺激骨形成[12]。而血管內皮細胞分泌的一氧化氮可通過旁

分泌的形式作用于破骨細胞，抑制其骨吸收功能[13]。

以上結果提示：血管內皮細胞合成和分泌的調節因子對成骨細胞及破骨細胞均具有調控作用。此外，種植體的愈合過程必須依賴充分的血供，血管內皮細胞形成的新生血管為氧氣、營養物質及代謝廢物的運輸提供通道。因此，血管內皮細胞為種植體界面的愈合提供了良好的生物學基礎。

血管內皮細胞在種植材料表面的黏附情況，直接影響到其增殖、分化以及在種植體-骨界面愈合中的作用。本實驗通過吖啶橙染色，在熒光顯微鏡下觀察、比較血管內皮細胞在兩種不銹鋼材料表面的黏附情況。其原理為：吖啶橙能與活細胞中雙螺旋DNA結合，形成發綠色熒光的復合物。在共培養1、2 d后，含銅不銹鋼組表面黏附的內皮細胞多于316L不銹鋼組。Barbucci等[14]等研究表明：含有Cu2+的透明質酸復合物對血管內皮細胞的遷移和黏附具有促進作用。此外，MTT檢測結果也顯示，含銅不銹鋼組細胞的增殖活性高于316L不銹鋼組。分析原因可能是含銅不銹鋼富銅相中的銅以Cu2+形式溶出，對血管內皮細胞的增殖產生影響[15]。

增殖和凋亡兩者的動態平衡維持著組織的正常形態和功能。不同的合金材料由于成分、金相等差異，在析出金屬離子的種類上有所不同，對黏附其表面細胞的影響也各有差別[16]。Annexin V作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一，其原理為：細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylse-rine，PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V能與外側的PS特異性結合，標記早期凋亡的細胞。本研究通過流式細胞儀檢測血管內皮細胞早期凋亡率，結果發現，316L不銹鋼組的細胞凋亡率高于含銅不銹鋼組，兩者差異有統計學意義（P<0.05）。分析原因為：兩種不銹鋼各自的組成成分不同，進而引起細胞凋亡率之間存在差異。從而進一步推測，含銅不銹鋼析出的Cu2+可能參與調控血管內皮細胞凋亡過程中的某一環節[17]。

本實驗僅從細胞水平研究含銅不銹鋼對血管內皮細胞黏附、增殖及凋亡的影響，而析出的Cu2+與血管內皮細胞的具體作用機制則有待于從分子水平進一步探究。

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（本文編輯 杜冰）