奧沙利鉑對口腔鱗狀細胞癌的時辰治療

趙寧波　楊凱　唐洪　趙春蓉　陳丹　陳睿

[摘要] 目的 比較奧沙利鉑（L-OHP）在晝夜4個不同時間治療口腔鱗狀細胞癌的療效和不良反應的差異，并分析其晝夜生物節律特征。方法 將75只裸鼠置于12 h光照/12 h黑暗交替的環境中，將人頰鱗狀細胞癌BcaCD885細胞注入裸鼠頰部建立口腔頰鱗狀細胞癌模型，3周成瘤后隨機分為5組（4個實驗組，1個對照組），每組15只。4個實驗組分別在24 h內的4個不同時間點，即燈亮后4、10、16、22 h（4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO）分別靜脈注射L-OHP（17 mg·kg-1），對照組靜脈注射相同體積的生理鹽水。給藥后觀察比較各組的療效（抑瘤率和生存時間）、

不良反應（體重、白細胞計數和肛周腫脹）情況，并用余弦分析法檢驗療效和不良反應是否具有晝夜節律性。結果 在4、16和22 HALO時間注射L-OHP均獲得較好的抑瘤率，但只有在16和22 HALO兩個時間給藥顯著延長了荷瘤鼠的生存時間；在16和22 HALO時間給藥，荷瘤鼠的不良反應顯著小于4和10 HALO給藥；余弦分析表明不同給藥時間對小鼠的生存時間、體重和白細胞計數的改變具有明顯的晝夜節律變化特征，其中14.88 HALO注射L-OHP荷瘤鼠的生存時間最長。結論 用L-OHP對口腔鱗狀細胞癌患者化療應考慮時間因素，以增效減毒、提高患者生存率和生存質量。

[關鍵詞] 時辰治療； 鱗狀細胞； 口腔癌； 療效； 不良反應； 晝夜節律

[中圖分類號] R 739.8 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.005

口腔癌約占全身惡性腫瘤的2%，其中90%為鱗狀細胞癌。盡管手術、化療和放療取得了一些進步，但口腔癌患者的5年總生存率仍然只有50%～60%[1-2]，因此，探索口腔癌新型有效的治療方法具有重大意義。

人體的許多生理活動，如細胞新陳代謝和增殖等，在體內“生物鐘”的調控下具有明顯的晝夜生

物節律性，生物鐘的調控中樞位于人體下丘腦基底部的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），它通過神經介質和激素使人體的生理活動隨24 h明暗交替呈規律性變化[3-4]。目前研究發現：人體正常細胞和腫瘤細胞的生長、增殖以及影響藥物分解代謝酶的活性有明顯的時間節律，使一些抗癌藥物隨給藥時間的不同抗癌活性和不良反應產生顯著差異[5]。時辰化療就是根據機體自身生物節律，選擇合適用藥時間，以達到最大療效和最小不良反應，提高患者的生存率和生存質量[5-6]。

鉑類抗癌藥物是目前治療口腔鱗狀細胞癌最常用和最有效的藥物之一，目前研究顯示：鉑類藥物的抗癌活性和不良反應具有晝夜時辰特征[4-5]。為了深入了解鉑類藥物對口腔鱗狀細胞癌的時辰作用和規律，本研究將人口腔頰鱗狀細胞癌BcaCD885細胞注入裸鼠頰部，建立裸鼠BcaCD885頰鱗狀細胞癌模型，用第3代新型鉑類抗癌藥物奧沙利鉑（Oxaliplatin，L-OHP）在晝夜4個不同時間給藥，觀察和比較不同時間給藥后藥物的抑瘤率、小鼠生存時間和不良反應，并行余弦分析檢驗不同時間給藥的療效和不良反應是否有晝夜節律性以及晝夜節律性規律，為臨床更加安全、有效地用藥提供依據。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

人頰鱗狀細胞癌細胞株BcaCD885（四川大學口

腔疾病研究國家重點實驗室），L-OHP、RPMI 1640培養基（Sigma公司，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國），冷凍低速離心機（Z233MK-2，HERMLE公

司，德國），光學顯微鏡（CYMML-EPXFU-068，Ni-kon公司，日本）。

1.2 實驗動物

選取重慶醫科大學實驗動物中心提供的無特定病原體（SPF）級別BALB/c nu/nu品系裸鼠75只為研究對象，雌性，5～6周齡，體重19～20 g。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠BcaCD885頰鱗狀細胞癌模型的建立 將75只裸鼠置于標準化12 h光照/12 h黑暗環境中分籠飼養，每籠5只，墊料、飼料和飲水均經滅菌處理，室溫為（24±1） ℃，空氣濕度為60%±10%。時間以開燈后時間（hours after lights on，HALO）為參考，0 HALO為開燈時間，12 HALO為關燈時間，即12 HALO前為休息相，12 HALO后為活動相。實驗前，裸鼠在此環境中適應3周。所有實驗操作程序均經過重慶醫科大學實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準。

將BcaCD885細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，然后放入37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。取對數生長期的BcaCD885細胞，經0.25%胰酶消化，冷凍低速離心（4 ℃，1 000 r·min-1，離心

半徑3 cm）5 min后，用無菌PBS配制成單細胞懸液。將0.2 mL含有2×106個BcaCD885細胞的懸液植入裸鼠頰部，繼續在標準化12 h光照/12 h黑暗環境中分籠飼養。每天觀察腫瘤生長情況，3周明顯成瘤后進行實驗。

1.3.2 給藥方法和時間 按照隨機數字表法，將75只荷瘤裸鼠隨機分為5組，每組15只，即4個實驗組和1個對照組。將L-OHP粉末用0.9%生理鹽水配制成濃度為3.4 g·L-1溶液。4個實驗組分別在24 h內的4個不同時間點，即燈亮后4、10、16、22 h（4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO）分別尾靜脈注射L-OHP（17 mg·kg-1），而對照組在以上4個不同時間點

尾靜脈注射相同體積的0.9%生理鹽水。

1.3.3 療效評價 療效評價指標如下。1）抑瘤率：在給藥后第7天的22 HALO時，用游標卡尺對5組裸鼠腫瘤的最大徑（a）和最小徑（b）進行測量，腫瘤體積（V）=0.5ab2，抑瘤率=（對照組腫瘤平均體積-給藥組腫瘤平均體積）/對照組腫瘤平均體積×100%。2）生存時間：給藥后每只荷瘤鼠存活的天數。

1.3.4 不良反應 用外周血白細胞（white blood cell，

WBC）計數、荷瘤鼠體重和肛周腫脹率評估不良反應。即在給藥后第7天，用電子天平稱重裸鼠體重，觀察裸鼠肛周腫脹情況；用清潔干燥的微量血紅蛋白吸管刺入裸鼠尾靜脈吸取靜脈血20 μL，用人工血細胞計數方法檢測外周血WBC數量。

1.4 統計學分析

采用Sigmaplot 12.0軟件對數據進行分析，多均數比較用方差分析，率的比較用??2檢驗；應用CircWave V 1.4軟件行余弦分析，檢驗各指標是否具有晝夜節律性；繪制Kaplan-Meier生存曲線，用log-rank方法檢驗組間生存時間的差異性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組荷瘤鼠抑瘤率的比較

晝夜4個不同時間注射L-OHP 7 d后各組抑瘤率的測量結果見表1。不同時間給藥其抑瘤率差異有統計學意義（??2=96.54，P<0.001）。在10 HALO給藥抑瘤率最小，顯著低于其他3個時間給藥的抑瘤率；在4、16和22 HALO時間注射L-OHP均獲得較好的抑瘤率，但三者抑瘤率差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 各組荷瘤鼠生存時間的比較

5組荷瘤鼠的平均生存時間見表1。5組荷瘤鼠的

平均生存時間的總體差異有統計學意義（F=11.264，

P<0.001）。其中，4 HALO組和10 HALO組與對照組之間差異無統計學意義（P>0.05），即表明在4 HALO和10 HALO時間點用藥未顯著延長荷瘤鼠生存時間。16 HALO組和22 HALO組與對照組之間差異有統計學意義（P<0.05），證明在16 HALO和22 HALO時間點用

藥顯著延長了荷瘤鼠的生存時間，但是16 HALO和22 HALO組間小鼠生存時間差異無統計學意義（P>0.05）。以上證明在活動相注射L-OHP能顯著延長荷瘤鼠的生存時間。

余弦分析表明：不同時間注射L-OHP后荷瘤鼠的平均生存時間有晝夜節律性（F=7.95，P=0.000 9）。

根據余弦擬合曲線顯示：2.86 HALO時注射L-OHP荷瘤鼠生存時間最短，為12.02 d；14.88 HALO時注射L-OHP荷瘤鼠生存時間最長，為20.75 d（圖1）。

Kaplan-Meier生存曲線分析：10 HALO組裸鼠生存時間最短，16 HALO組裸鼠生存時間最長（log-rank ??2=13.84，P<0.01），具體見圖2。

2.3 各組荷瘤鼠不良反應的比較

2.3.1 WBC計數 在晝夜4個不同時間點注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC均發生顯著性減少，其中，10 HALO組WBC減少最多，16 HALO組WBC減少最少。5組荷瘤鼠WBC的差異有統計學意義（F=274.42，P<0.001），

并且不同組之間兩兩比較荷瘤鼠WBC的差異均具有統計學意義（P<0.001）（表1）。余弦分析表明：不同

時間注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC減少具有晝夜節律性（F=62.13，P<0.001）。根據余弦擬合曲線顯示：

18.80 HALO注射L-OHP導致荷瘤鼠WBC減少最少，

為15.43×103·μL-1，6.81 HALO注射L-OHP導致荷瘤鼠WBC減少最多，為14.19×103·μL-1（圖3）。

2.3.2 荷瘤鼠體重 5組荷瘤鼠體重的總體差異有統計學意義（F=41.48，P<0.001），其中，10 HALO組和

對照組之間荷瘤鼠的體重差異無統計學意義（t=0.548，

P>0.05）。4 HALO、16 HALO以及22 HALO組與對照組之間差異具有統計學意義（P<0.05），但4 HALO和22 HALO組之間差異無統計學意義（P>0.05），16 HALO與4 HALO和22 HALO之間差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。余弦分析表明：不同時間點注射L-OHP后荷瘤鼠的體重具有晝夜節律性（F=3.49，P<0.05），根據余弦擬合曲線顯示：16.85 HALO注射L-OHP后荷瘤鼠體重值最大，為19.20 g，4.85 HALO注射L-OHP荷瘤鼠體重值最小，為18.85 g（圖4）。

2.3.3 肛周腫脹率 5組荷瘤鼠肛周腫脹率差異有統計學意義（??2=16.996，P<0.01）。10 HALO組肛周腫脹率最高，為60.00%（9/15）；16 HALO組肛周腫脹率最低，為13.33%（2/15）。4 HALO和10 HALO組與16 HALO組之間荷瘤鼠的肛周腫脹率差異有統計學意義（P<

0.05），但16 HALO和22 HALO之間荷瘤鼠肛周腫脹率差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。證明在活動相注射L-OHP較休息相顯著降低了荷瘤鼠的肛周腫脹率。

3 討論

化療是口腔鱗狀細胞癌綜合治療的重要組成部分。鉑類抗癌藥物是目前治療口腔癌最常用和最有效的藥物之一，目前在臨床上用于口腔鱗狀細胞癌的化療方案幾乎全部含有鉑類抗癌藥物[7]。L-OHP是

近年來研制出的第三代鉑類抗癌藥物，含有一個1，2二氨環己烷基團（DACH），L-OHP活化后DACH環和

鉑與癌細胞的DNA結合成鉑-DNA復合體，形成鏈內及鏈間交聯，從而阻止DNA的復制和轉錄，導致細胞周期非特異性死亡[8]。目前研究證明：人體正常細

胞和腫瘤細胞的增殖、DNA合成水平有明顯的晝夜時間節律，增殖和DNA合成越活躍的細胞對化療藥物越敏感，由于腫瘤細胞DNA合成和增殖的時間節律變化與人體正常細胞（骨髓、消化道黏膜上皮等）之間一般存在8～12 h時差，這就為不同時間應用化療藥物既能最大殺傷癌細胞，同時又盡量減少對正常細胞的損傷提供了基礎[4-6]。

現已發現有30多種細胞毒藥物具有時辰化療的特點，目前許多動物實驗和一些多醫療中心通過時辰治療結腸癌、乳腺癌和肺癌等臨床經驗證實[4-6，9-10]：金屬鉑類抗癌藥物在不同時間用藥所產生的抗癌療效和對機體的不良反應具有顯著性差異。筆者前期的臨床研究也證明：卡鉑抗癌藥物對口腔鱗狀細胞癌患者在不同時間用藥可達到減毒增效的目的[11]。但

目前腫瘤的時辰化療研究主要是集中在對藥物近期療效的觀察，缺乏長期療效，如生存率的比較觀察。實驗常是對鉑類抗癌藥物聯合其他藥物的聯合化療方案的總體結果觀察，缺乏對鉑類抗癌藥物單一化療作用的觀察。另外，目前的腫瘤時辰治療研究通常只是比較不同時間用藥后療效和不良反應的差異，沒有對其是否具有晝夜生物節律性進行驗證和分析。目前以余弦函數為模型發展起來的余弦分析是分析生物節律性資料的有效方法，它能排除其他生物因素的干擾，將需要研究的生物節律分離，并將其特征用余弦擬合曲線直觀地表示出來[12]。

在臨床上L-OHP常和其他抗癌藥物聯合應用，本研究用單一L-OHP治療，其目的是更好發現L-OHP治療口腔鱗狀細胞癌的晝夜時辰特點。本研究發現：在10 HALO時間給藥荷瘤鼠的抑瘤率和生存時間顯著低于其他給藥時間，盡管4 HALO時間給藥的抑瘤率與16和22 HALO時間給藥的抑瘤率差異無統計學意義，但4 HALO時間給藥并沒有延長荷瘤鼠的生存時間，只有在16和22 HALO兩個時間給藥顯著延長了荷瘤鼠的生存時間。同時余弦分析證明不同時間注射L-OHP后荷瘤鼠的平均生存時間具有晝夜節律性，根據擬合的余弦曲線可知，2.86 HALO時（休息

相早期）注射L-OHP荷瘤鼠生存時間最短，為12.02 d；14.88 HALO時（活動相早期）注射L-OHP荷瘤鼠生存時間最長，為20.75 d。

由于L-OHP的主要不良反應為骨髓抑制、消化道黏膜上皮損傷[8]。本研究選擇給藥后小鼠的體重（反映體質狀況）、WBC計數（反映骨髓抑制情況）和肛周腫脹（反映胃腸道毒性情況）來評價不良反應[8，13]。本研究發現：在4、10、16和22 HALO 4個時間點用藥7 d后荷瘤鼠的體重、WBC計數和肛周腫脹率差異均有統計學意義。10 HALO給藥后小鼠體重最輕，16 HALO給藥后小鼠體重最重，即證明在16 HALO用藥對小鼠全身體質狀況影響最小。余弦分析證明不同時間注射L-OHP后荷瘤鼠的體重有晝夜節律性，16.85 HALO（活動相中期）注射L-OHP對荷瘤鼠體重影響最小，即對全身體質狀況影響最小；4.85 HALO（休息

相中期）注射L-OHP對荷瘤鼠體重影響最大，即對荷

瘤鼠全身體質狀況影響最大。WBC計數結果也表明：

在10 HALO給藥后小鼠WBC減少最多，16 HALO組WBC減少最少，即證明在16 HALO給藥對小鼠骨髓抑制最輕。余弦分析證明不同時間注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC具有晝夜節律性，18.80 HALO（活動相

中期）注射L-OHP導致荷瘤鼠WBC減少最少，即對骨髓抑制最小；6.81 HALO（休息相中期）注射L-OHP

導致荷瘤鼠WBC減少最多，即對骨髓抑制最大。肛周腫脹結果也表明：在10 HALO（休息相晚期）注射L-OHP后荷瘤鼠肛周腫脹率最高（60.00%），證明對胃

腸道毒性作用最大，在16 HALO（活動相早期和中期的轉化時期）給藥肛周腫脹率最低（13.33%），對胃腸道毒性作用最小。

目前越來越多的學者認為：化療用藥時間的合理安排與用藥劑量具有同等重要的地位[14]。本研究

表明：在晝夜不同時間用L-OHP靜脈注射治療口腔鱗狀細胞癌其產生的療效和不良反應差異有統計學意義，并且這種差異的波動具有24 h晝夜節律性，在16和22 HALO兩個時間用L-OHP能顯著延長口腔鱗狀細胞癌小鼠的生存時間。總體來看：L-OHP在活動相早期的后段時間和中期的前段時間用藥所獲得的療效最好，不良反應最小；而在休息相早期和中期給藥，其療效最差，不良反應最大。盡管鼠類是夜行動物，其休息相和活動相與人類相反，但目前研究證明：從鼠類的休息相和活動相所獲得的實驗結果可以外推到人的相應休息相和活動相[5-6]。因此，對口腔鱗狀細胞癌患者的化療應考慮時間因素，以增效減毒、提高患者生存率和生存質量。

[參考文獻]

[1] Kademani D， Bell RB， Schmidt BL， et al. Oral and maxillofacial

surgeons treating oral cancer： A preliminary report from the Ame-

rican Association of Oral and Maxillofacial Surgeons Task Force

on Oral Cancer[J]. J Oral Maxillofac Surg， 2008， 66（10）：2151-

2157.

[2] Kademani D， Bell RB， Bagheri S， et al. Prognostic factors in in-

traoral squamous cell carcinoma： The influence of histologic grade

[J]. J Oral Maxillofac Surg， 2005， 63（11）：1599-1605.

[3] Eismann EA， Lush E， Sephton SE. Circadian effects in cancer-

relevant psychoneuroendocrine and immune pathways[J]. Psycho-

neuroendocrinology， 2010， 35（7）：963-976.

[4] Huang XL， Fu CJ， Bu RF. Role of circadian clocks in the deve-

lopment and therapeutics of cancer[J]. J Int Med Res， 2011， 39

（6）：2061-2066.

[5] Lévi F， Okyar A， Dulong S， et al. Circadian timing in cancer

treatments[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2010， 50：377-421.

[6] Lévi F. Chronotherapeutics： The relevance of timing in cancer

therapy[J]. Cancer Causes Control， 2006， 17（4）：611-621.

[7] 溫玉明. 口腔頜面部腫瘤現代理論與臨床實踐[M]. 北京： 人民

衛生出版社， 2004：651-657.

Wen Yuming. Oral and maxillofacial oncology—the contemporary

conceptions and clinical practice[M]. Beijing： Peoples Medical

Publishing House， 2004：651-657.

[8] Kelland L. Broadening the clinical use of platinum drug-based

chemotherapy with new analogues. Satraplatin and picoplatin[J].

Expert Opin Investig Drugs， 2007， 16（7）：1009-1021.

[9] Lévi F， Zidani R， Misset JL. Randomised multicentre trial of chro-

notherapy with oxaliplatin， fluorouracil， and folinic acid in metas-

tatic colorectal cancer. International Organization for Cancer Chro-

notherapy[J]. Lancet， 1997， 350（9079）：681-686.

[10] Smolensky MH， Peppas NA. Chronobiology， drug delivery， and

chronotherapeutics[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2007， 59（9/10）：828-

851.

[11] 楊凱， 陳睿， 喻秀麗. 口腔癌時辰化療[J]. 實用口腔醫學雜志，

2005， 21（3）：389-391.

Yang Kai， Chen Rui， Yu Xiuli. Neoadjuvant chrono-chemotherapy

for the patients with oral squamous cell carcinoma[J]. J Pract Sto-

matol， 2005， 21（3）：389-391.

[12] Manoharan S， Baskar AA， Manivasagam T， et al. Circadian rhyth-

micity of plasma lipid peroxidation and antioxidants in oral squa-

mous cell carcinoma[J]. Singapore Med J， 2005， 46（4）：184-188.

[13] Wood PA， Du-Quiton J， You S， et al. Circadian clock coordinates

cancer cell cycle progression， thymidylate synthase， and 5-fluo-

rouracil therapeutic index[J]. Mol Cancer Ther， 2006， 5（8）：2023-

2033.

[14] Mormont MC， Levi F. Cancer chronotherapy： Principles， applica-

tions， and perspectives[J]. Cancer， 2003， 97（1）：155-169.

（本文編輯 杜冰）