非白色假絲酵母菌代謝產(chǎn)物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用

陳斌 車團(tuán)結(jié) 白德成 何祥一

[摘要] 目的 研究3種常見的非白色假絲酵母菌對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。方法 制備熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液并行倍比稀釋，設(shè)1、4、16倍3個(gè)稀釋度以及對(duì)照組。體外培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，分別將3種非白色假絲酵母菌不同稀釋度的上清液與ECV304細(xì)胞共培養(yǎng)，采用MTT法測(cè)定培養(yǎng)24、48、72 h后的細(xì)胞增殖率；倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)48 h后細(xì)胞密度的變化；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定培養(yǎng)48 h后對(duì)ECV304細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 培養(yǎng)24 h后，3種假絲酵母菌1倍稀釋的上清液均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，4倍稀釋的克魯斯假絲酵母菌也可促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.05）；培養(yǎng)48、72 h后，克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液仍可促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖，而熱帶假絲酵母菌上清液無(wú)論稀釋度高低均不能促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖。培養(yǎng)48 h后，克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液組的細(xì)胞密度明顯增高，同時(shí)其G0/G1期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）升高（P<0.05）；而熱帶假絲酵母菌組的細(xì)胞密度和PI均無(wú)明顯變化（P>0.05）。結(jié)論 克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的代謝產(chǎn)物對(duì)ECV304細(xì)胞的增殖有誘導(dǎo)作用，臨床上應(yīng)加強(qiáng)非白色假絲酵母菌感染的檢測(cè)和治療。

[關(guān)鍵詞] ECV304細(xì)胞； 非白色假絲酵母菌； 增殖； 代謝產(chǎn)物

[中圖分類號(hào)] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.018

假絲酵母菌（Saccharomyces）是一種條件致病菌，常分布在人體的腸道、泌尿道、皮膚和口咽黏膜等處。當(dāng)宿主存在營(yíng)養(yǎng)攝入不足、免疫力降低，以及長(zhǎng)期配戴義齒等誘發(fā)因素時(shí)，易引起口腔黏膜感染假絲酵母菌，發(fā)生口腔假絲酵母菌病[1-2]。近年來(lái)，

隨著免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物、廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，器官移植術(shù)及導(dǎo)管介入等各種治療方法的開展，以及獲得性免疫缺陷綜合征、糖尿病、惡性腫瘤等疾病患病率的升高，由此導(dǎo)致的宿主免疫功能低下或菌群失調(diào)人群的增多，使得口腔假絲酵母菌感染率迅速上升[3-4]。在能引起人類感染的假絲酵母菌中，白色假絲酵母菌（Saccharomyces albicans）

是最主要、最常見的致病菌[3，5]；但是，近年來(lái)假絲酵母菌病的致病菌譜有所變遷，由非白色假絲酵母菌引起的感染不斷增加。

本課題組前期研究[6]表明：白色假絲酵母菌的代謝產(chǎn)物是重要的致病成分，可引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的增殖。為進(jìn)一步探討非白色假絲酵母菌在口腔中的致病作用，本研究采用3種常見的非白色假絲酵母菌代謝產(chǎn)物與體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

熱帶假絲酵母菌（Saccharomyces tropicalis）ATCC 750、克魯斯假絲酵母菌（Saccharomyces krusei）ATCC 6258、光滑假絲酵母菌（Saccharomyces glabrata）CC-UG 32725，由芬蘭赫爾辛基大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究院惠贈(zèng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所。MTT（Sigma公司，美國(guó)）；RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青

生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（Gibco公司，美

國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 假絲酵母菌上清液的制備 3種假絲酵母菌在37 ℃沙堡氏液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h后，用高壓滅菌PBS稀釋各菌液，至OD600為1.00±0.05時(shí)，將菌液置于7 000 r·min-1、4 ℃條件下離心20 min。取上清液，采用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，超聲破碎，再用0.22 μm濾膜二次過(guò)濾除菌后得到假絲酵母菌上清液，備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組：熱帶假絲酵母菌組、克魯斯假絲酵母菌組和光滑假絲酵母菌組的上清液分別用PBS倍比稀釋，設(shè)1、4、16倍共3個(gè)稀釋度。對(duì)

照組：3組加入等量PBS。

1.2.3 ECV304細(xì)胞傳代培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的ECV304細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、95%空氣及飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁的75%以上時(shí)傳代，收獲指數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞，備用。

1.2.4 ECV304細(xì)胞增殖率的測(cè)定 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×105個(gè)，接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌倍比（1、4、16倍）稀釋的上清液10 μL分別加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每孔10 μL；對(duì)照組加入PBS，每孔10 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）液120 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度A值。每組設(shè)5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.2.5 ECV304細(xì)胞密度的變化 將ECV304細(xì)胞制成密度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種在6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后每孔分別加入200 μL 1倍稀釋的熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的上清液，以等體積PBS作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察ECV304細(xì)胞密度的變化。

1.2.6 ECV304細(xì)胞周期的變化 用完全培養(yǎng)液調(diào)整ECV304細(xì)胞密度為每毫升5×104個(gè)，每瓶加入10 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換完全培養(yǎng)液，分別加入1 mL 1倍稀釋的熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的上清液。另設(shè)加入1 mL PBS的組為對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，2.5 g·L-1胰酶消化收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA的周期性變化，分析各組G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，并計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果采用x±s表示，分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 非白色假絲酵母菌上清液對(duì)ECV304細(xì)胞增殖作

用的影響

不同稀釋度的3種非白色假絲酵母菌上清液作用ECV304細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)ECV304細(xì)胞增殖作用的影響見表1、2。作用24 h時(shí)，3種假絲酵母菌1倍稀釋的上清液作用EVC304細(xì)胞均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；4倍稀釋時(shí)，僅有克魯斯假絲酵母菌上清液可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；16倍稀釋時(shí)，3種菌均無(wú)促細(xì)胞增殖作用，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

作用48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，克魯斯假絲酵母菌所有稀釋度的上清液均可促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.01）；光滑假絲酵母菌上清液在1倍和4倍稀釋時(shí)，可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.05），但在16倍稀釋時(shí)無(wú)明顯作用（P>0.05）；而熱帶假絲酵母菌3種稀釋度的上清液對(duì)細(xì)胞促增殖作用均不明顯（P>0.05）。

作用72 h時(shí)，光滑假絲酵母菌各稀釋度上清液均可促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；克魯斯假絲酵母菌上清液在1倍和4倍稀釋時(shí)，可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但在稀釋16倍時(shí)無(wú)

明顯促增殖作用（P>0.05）；熱帶假絲酵母菌3種稀釋度的上清液均無(wú)明顯的促增殖作用，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

細(xì)胞增殖率結(jié)果顯示：克魯斯假絲酵母菌1倍和

4倍稀釋的上清液，以及光滑假絲酵母菌1、4和16倍稀釋的上清液都是在培養(yǎng)72 h時(shí)促細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)。

2.2 非白色假絲酵母菌上清液對(duì)ECV304細(xì)胞密度變

化的影響

ECV304細(xì)胞經(jīng)3種假絲酵母菌上清液處理48 h后的細(xì)胞密度見圖1。與對(duì)照組（圖1a）相比，熱帶假絲酵母菌上清液組（圖1b）的細(xì)胞密度無(wú)明顯變化；克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液組（圖1c和圖1d）的細(xì)胞密度明顯高于熱帶假絲酵母菌上清液組

與對(duì)照組。

2.3 非白色假絲酵母菌上清液對(duì)ECV304細(xì)胞周期的

影響

3種非白色假絲酵母菌上清液在作用ECV304細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞周期時(shí)相的測(cè)定結(jié)果見表3。與對(duì)照組相比，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞所占比例均升高；克魯斯假絲酵母菌組和光滑假絲酵母菌組G0/G1期細(xì)胞所占比例較對(duì)照組均降低，而反映細(xì)胞增殖活力的指數(shù)PI均升高；上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

熱帶假絲酵母菌組G0/G1期細(xì)胞所占比例和PI與對(duì)照組相比均無(wú)明顯變化（P>0.05）。

3 討論

假絲酵母菌是口腔常見的共生菌，在健康人群中的檢出率將近50%[7]。但是有學(xué)者[8]認(rèn)為口腔假絲

酵母菌感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。9%～40%的口腔癌癥患者可并發(fā)假絲酵母菌白斑，而其中2%～6%的白斑可發(fā)生惡變[9]。研究[10]證實(shí)：侵入的口腔假絲酵母菌能引起口腔上皮的增生。Barrett等[11]認(rèn)

為：假絲酵母菌感染與中、重度上皮增生甚至惡變密切相關(guān)。有學(xué)者[12]利用口腔假絲酵母菌與口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)假絲酵母菌可引起口腔上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生改變， 細(xì)胞增殖活力升高。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅取決于口腔黏膜上皮細(xì)胞，也與口腔黏膜下血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞能快速增生、遷移形成腫瘤新生血管，是腫瘤血管生成的靶細(xì)胞，可以為腫瘤的發(fā)展運(yùn)輸養(yǎng)分并排出代謝產(chǎn)物；此外，新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌某些生長(zhǎng)因子以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與移動(dòng)。腫瘤的增長(zhǎng)速度在很大程度上取決于營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)2 mm3左右時(shí)，已不能單純依靠彌散方式獲取氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此時(shí)若無(wú)新生毛細(xì)血管長(zhǎng)入，腫瘤組織將處于休眠狀態(tài)或發(fā)生退化[13]。

目前已有研究[14]從體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面

探討了白色假絲酵母菌的致病潛力，認(rèn)為該菌是最常見、致病性最強(qiáng)的一種口腔假絲酵母菌。本課題組前期研究[6]顯示：白色假絲酵母菌代謝產(chǎn)物可引起

ECV304細(xì)胞的增殖，是重要的致病成分。有研究[8，15]發(fā)現(xiàn)：白色假絲酵母菌與口腔腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，非白色假絲酵母菌例如光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克魯斯假絲酵母菌等也是主要的致病菌[16]。近年來(lái)，致病性假絲酵母菌的菌譜

有所變遷，即由非白色假絲酵母菌引起的感染不斷增加，而針對(duì)非白色假絲酵母菌代謝產(chǎn)物致病性的研究還較少。ECV304細(xì)胞是通過(guò)分離健康產(chǎn)婦正常娩出的胎盤游離端臍帶的臍靜脈得到的永生血管內(nèi)皮細(xì)胞株，早在1984年國(guó)外已有學(xué)者應(yīng)用其進(jìn)行感染菌與宿主細(xì)胞交互作用方面的實(shí)驗(yàn)探索[17]。

本研究結(jié)果顯示：利用非白色假絲酵母菌上清液與細(xì)胞共培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時(shí)間（24、48、72 h）

和不同稀釋度作用下，3種非白色假絲酵母菌上清液促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖的作用有所不同。短時(shí)間（24 h）作用后，3種菌的1倍稀釋上清液以及克魯斯

假絲酵母菌的4倍稀釋上清液可促進(jìn)細(xì)胞增殖。長(zhǎng)時(shí)間（48、72 h）作用后，高稀釋度的克魯斯假絲酵母菌上清液（16倍稀釋，48 h）和光滑假絲酵母上清液（16倍稀釋，72 h）仍有促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖的作用，而熱帶假絲酵母菌上清液無(wú)論稀釋度高低均不能促進(jìn)ECV304細(xì)胞增殖；細(xì)胞增殖率結(jié)果顯示：克魯斯假絲酵母菌1倍和4倍稀釋的上清液，以及光滑假絲酵母菌1、4和16倍稀釋的上清液都是在培養(yǎng)72 h時(shí)促細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)。

高稀釋度的克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌在長(zhǎng)時(shí)間作用細(xì)胞后仍可促進(jìn)細(xì)胞增殖這一結(jié)果，與本課題組前期對(duì)白色假絲酵母菌的研究結(jié)果[6]有

所不同，提示克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的代謝產(chǎn)物可能不同于白色假絲酵母菌，前兩種菌的代謝產(chǎn)物能分解或轉(zhuǎn)化成促細(xì)胞增殖作用更大的毒性物質(zhì)。該結(jié)果提示臨床上對(duì)于假絲酵母菌長(zhǎng)期慢性感染的患者，更應(yīng)注重克魯斯假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌的防治和監(jiān)測(cè)。

增殖旺盛的細(xì)胞處于S期和G2/M期的比例較高。本研究結(jié)果顯示：克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液組G0/G1期細(xì)胞所占比例均降低，而反映細(xì)胞增殖活力的指數(shù)PI均升高；熱帶假絲酵母菌組則無(wú)明顯變化。這說(shuō)明克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌上清液可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而熱帶假絲酵母菌上清液的促增殖作用不明顯。

有研究[18]顯示：腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型及功

能特性與正常靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯差異，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞呈不成熟及快速分裂狀態(tài)，與正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，其增殖活性可增高20～

2 000倍。本研究結(jié)果說(shuō)明：除了最常見、致病性最強(qiáng)的白色假絲酵母菌以外，克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的代謝產(chǎn)物也可誘導(dǎo)口腔黏膜上皮深層的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)口腔腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。控制口腔假絲酵母菌感染，首選氟康唑、伊曲康唑等藥物，但是假絲酵母菌對(duì)此類藥物特別是氟康唑耐藥性的增強(qiáng)，已越來(lái)越引起關(guān)注[3]。近年來(lái)，非白色假絲酵母菌引起的感染不斷增加，而且克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌對(duì)此類抗真菌藥并不敏感[2]。在進(jìn)行白色假絲酵母菌相關(guān)研究的同時(shí)，也要重視對(duì)非白色假絲酵母菌特別是克魯斯假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌致病機(jī)理的研究和新型特異性藥物的研制，加強(qiáng)臨床上非白色假絲酵母菌感染的檢測(cè)和治療。

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（本文編輯 吳愛華）