高遷移率族蛋白1在慢性牙周炎病變牙齦組織中的表達

趙華強　穆萍萍　魏玲玲　侯萌　孫欽峰　宋暉　楊丕山

[摘要] 目的 研究慢性牙周炎病變牙齦組織中高遷移率族蛋白1（HMGB1）的表達。方法 提取健康志愿者外周血單核細胞（PBMC），以1 μg·mL-1的細菌脂多糖（LPS）刺激細胞，24 h后用免疫熒光染色法檢測HMGB1的表達，48 h后用酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清液中HMGB1的表達；分別以50 ng·mL-1腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和100 ng·mL-1

HMGB1刺激PBMC，48 h后檢測細胞上清液中HMGB1和TNF-α的表達。另外收集健康者和慢性牙周炎患者的牙齦組織和齦溝液，分別檢測牙齦組織和齦溝液內HMGB1的表達。結果 LPS刺激PBMC 24 h后，HMGB1自細胞核移出至細胞質中；刺激48 h后，細胞上清液中HMGB1的表達量明顯高于對照組（P<0.01）。TNF-α和HMGB1分別刺激

PBMC 48 h后，上清液中HMGB1和TNF-α的表達水平較對照組亦有明顯增強（P<0.01）。在慢性牙周炎牙齦組織上

皮釘突下方浸潤的細胞中，HMGB1自細胞核轉移至細胞質和細胞外；其齦溝液內HMGB1的表達量也明顯高于健康對照組（P<0.01）。結論 HMGB1可能在牙周炎病理進程中有重要作用。

[關鍵詞] 高遷移率族蛋白； 牙周炎； 齦溝液； 外周血單核細胞

[中圖分類號] R 781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.019

慢性牙周炎在發生發展過程中，牙周致病菌及其產物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可激活宿主的免疫系統，導致大量免疫活性細胞浸潤和多種炎癥介質釋放，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，

TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）

等。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，

HMGB1）是存在于真核生物細胞內高度保守的一類

含量豐富的非組蛋白染色體結合蛋白。研究[1]發現：細胞內HMGB1可通過活化細胞的主動分泌，或通過壞死、受損細胞的被動釋放進入細胞外，誘導下游其他炎癥因子的產生，而這又會導致更多的HMGB1釋放[2]。由此可見，HMGB1是一種重要的晚期致炎

因子，對于炎癥的進程和預后有著重要的作用，較TNF-α、IL-1β等早期速發型炎癥因子具有更重要的臨床意義。目前，已發現HMGB1在胰腺炎[3]、敗

血癥[4-5]等感染性疾病中具有重要作用，但在牙周炎病變組織中的表達情況還少有研究。

本研究采集人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）建立體外實驗模型，研究

LPS刺激下細胞HMGB1的釋放情況及HMGB1與炎癥因子TNF-α之間的相互關系；另外，收集慢性牙周炎患者的病變牙齦組織和齦溝液，采用免疫組織化學染色和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno-

sorbent assay，ELISA）研究病變組織中HMGB1的表達情況，探討其在牙周炎病程中的變化和可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

兔抗HMGB1多克隆抗體（Biomol公司，美國），

德克薩斯紅耦聯羊抗兔IgG（Molecular Probes公司，

荷蘭），HMGB1和TNF-α的ELISA試劑盒（R&D;公司，美國）；Multiskan MK3型酶聯免疫分光光度儀（Ther-

mo Labsystems公司，芬蘭），共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2型，Leica Microsystems公司，德國），BX51型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Triton X-100，

大腸桿菌LPS（Sigma公司，美國），HMGB1（Abcam

公司，英國）。

1.2 人PBMC的提取

新鮮外周血取自1名健康志愿者（男性，24歲）。抽取外周靜脈血20 mL加入PBS溶液，吹打混勻。在50 mL Falcon離心管中加入15 mL Ficoll PaqueTM plus（Amersham Biosciences公司，瑞典），在其上加入血液和PBS的混合液，然后將離心管在20 ℃、400 g條件下離心40 min。離心后，將中間相液體取出，轉移至新的離心管中，加入PBS再離心10 min。棄掉上清液，加入含有NH4Cl和KHCO3的eryshock溶液，置于冰上10 min以去除紅細胞，其后將細胞經沖洗和離心后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養。

1.3 樣本收集

收集2009—2010年于山東大學口腔醫院牙周病科因慢性牙周炎行牙齦翻瓣手術的6例患者術中切除的病變牙齦組織作為試驗組，同期收集于山東大學口腔醫院口腔頜面外科行埋伏牙拔除術的4例患者所切除的健康牙齦組織標本作為健康對照組。6例牙周炎患者男性3例，女性3例；年齡48～70歲，平均（56.0±8.5）歲；術區牙齒平均探診深度為（6.63±

2.12） mm，平均附著喪失水平為（6.89±2.17） mm；

均已行牙周基礎治療。4例對照組患者中，男女各2例，年齡23～32歲，平均（26±7.8）歲。所有患者均于術前告之手術及取樣情況，并征得其同意。

1.4 免疫組織化學染色

提取的人PBMC加入1 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的PBMC作為對照。靜置24 h后，分別收集細胞滴于載玻片上，離心后以4%甲醛溶液常溫固定細胞1 h，加入0.5% Triton X-100進行透化作用，5 min后以含有2%胎牛血清白蛋白的緩沖液阻斷非特異反應，加入抗HMGB1抗體（1∶50）4 ℃下孵育過夜。反復沖

洗后加入德克薩斯紅耦聯的羊抗兔IgG（1∶200）常溫

孵育1 h，沖洗后封片，使用含有4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片液以顯示細胞核，熒光顯微鏡下觀察。切取的牙齦組織以4%甲醛溶液常溫固定1 h后以石蠟包埋。部分牙齦組織進行常規蘇木精-伊紅（hematine-eosin，

HE）染色；部分牙齦組織經脫蠟和乙醇梯度脫水后，以0.1 mol·L-1 C6H10O8和0.2 mol·L-1 Na2HPO4·2H2O進行抗原修復。抗原修復后行常規免疫組織化學染色。以含2%胎牛血清白蛋白的緩沖液阻斷非特異反應，然后加入抗HMGB1抗體（1∶50）4 ℃下孵育過夜，反復沖洗后加入德克薩斯紅耦聯的羊抗兔IgG（1∶200）常溫孵育1 h，反復沖洗后封片。共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 ELISA

人PBMC加入10 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的細胞作為對照。靜置48 h后，檢測上清液中HMGB1的表達。分別以50 ng·mL-1 TNF-α和100 ng·mL-1 HMGB1刺激PBMC，48 h后檢測上清液中HMGB1和TNF-α的水平。按照HMGB1和TNF-α ELISA試劑盒說明要求進行檢測。在試驗組患者進行牙周手術前，選擇術區牙周探診深度最深的2顆患牙，每顆牙選擇4個

位點（頰舌側近中和遠中）以自制濾紙條收集患者的齦溝液。合并每顆牙同側2個位點的齦溝液樣本，稀釋后按照HMGB1 ELISA試劑盒說明檢測齦溝液中HMGB1的含量。收集牙齦健康對照組患者相應牙齒的齦溝液作為對照。

1.6 統計學分析

采用SPSS 11.0軟件包進行統計學分析，統計方法為t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 人PBMC在LPS刺激下HMGB1釋放情況

正常情況下，人PBMC的HMGB1位于細胞核內，如圖1A所示：紅色染色（德克薩斯紅）的HMGB1位于藍色染色（DAPI）的細胞核內。以1 μg·mL-1的LPS刺激PBMC 24 h后，細胞核內的HMGB1轉移至細胞質內，表現為紅染的HMGB1移出細胞核轉移至細胞質中（圖1B中箭頭所示）。

PBMC經1 μg·mL-1的LPS刺激48 h后，收集細胞上清液行ELISA檢測，結果發現：未經LPS刺激的PBMC上清液中HMGB1表達量為（97.2±8.5） ng，經

LPS刺激后的表達量為（756.2±18.5） ng，二者差異有統計學意義（P<0.01）。該結果表明，經LPS刺激后，PBMC上清液中的HMGB1表達量明顯升高，提示細胞質中的HMGB1釋放至細胞外。

2.2 HMGB1與TNF-α表達的關系

以50 ng·mL-1的TNF-α刺激PBMC 48 h后，收集細胞上清液，用ELISA法檢測HMGB1表達水平，結果可見：TNF-α刺激后，PBMC上清液中的HMGB1表達量為（1 258.3±98.6） ng，較未受刺激時的（119.4±12.6） ng明顯增強（P<0.01）。以100 ng·mL-1的HMGB1刺激PBMC 48 h后，上清液中TNF-α表達量為（1 320.8±

91.6） ng，較未受刺激時的（103.9±20.5） ng明顯增強（P<0.01）。該結果提示：HMGB1可誘導TNF-α的產生，而TNF-α的產生也會導致HMGB1的釋放。

2.3 牙周炎患者病變牙齦組織中HMGB1的表達

牙周炎組和健康對照組牙齦組織的HE和免疫組織化學染色結果如圖2所示。與健康對照組牙齦組織（圖2左上）相比，牙周炎組牙齦組織（圖2右上）上皮釘突下方可見有大量白細胞浸潤及膠原組織破壞。由于牙周炎局部病變組織中浸潤的單核巨噬細胞被視為HMGB1的重要來源，本研究著重展示了上皮釘突下方細胞HMGB1的表達情況：健康對照組牙齦組織上皮釘突下方可見到HMGB1主要位于細胞核中（圖2左下）；而在牙周炎組牙齦組織中，HMGB1則表現為自細胞核轉移至細胞質中或至細胞外，可見淡染空虛的細胞核和核周及細胞間的紅染區域（圖2右下，箭頭示）。

2.4 牙周炎患者齦溝液中HMGB1的表達

牙周炎組和健康對照組齦溝液中HMGB1的表達量分別為（39.8±1.1） ng和（32.1±3.5） ng，二者差異有統計學意義（P<0.01），牙周炎組明顯高于健康對照組。

3 討論

HMGB1是在20世紀60年代發現的高度保守的非組蛋白染色質蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名[6]。HMGB1廣泛分布于淋巴組

織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織中，在肝、腦組織中主要存在于細胞質，而在其他多數組織中則存在于細胞核[7]。在炎癥等病理條件下，細胞核中

的HMGB1會轉移至細胞質中，繼而釋放至細胞外。

HMGB1的功能因其所處的位置而不同。位于細胞核內時，主要功能是穩定核小體構象和調節基因轉錄；釋放到細胞外后，則作為炎癥細胞因子在炎癥免疫反應中具有重要作用。

HMGB1通過兩種途徑釋放到細胞外。一是被動釋放，由于HMGB1和染色體的結合不如核蛋白牢固，細胞壞死時HMGB1和染色體解離釋放至細胞外；二是主動釋放，在激活的細胞中，如單核巨噬細胞，HMGB1由細胞核移至細胞質，然后進入溶酶體，通過胞吐作用分泌至細胞外。在移位的過程中，HMGB1被磷酸化。研究[8-10]表明，HMGB1的釋放是通過其

與細胞表面的糖基化終末產物受體（receptor for ad-

vanced glycation end-products，RAGE）和Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）-2、TLR-4的結合來實現的。在多種炎癥免疫性疾病，如風濕性關節炎[11]和

系統性紅斑狼瘡[12]]，均可見到HMGB1自細胞核移位的情況。細胞外的HMGB1已被證實在這些疾病的病理進程中具有重要作用。

本研究采用免疫組織化學和ELISA技術，證實了在細菌LPS的刺激下，人PBMC中的HMGB1首先自細胞核移位至細胞質中，繼而釋放至細胞外；此外，本研究還發現，HMGB1可以誘導牙周炎重要炎癥因子TNF-α的產生，而TNF-α的產生又會導致HMGB1的釋放。在這一炎癥增強放大環路中，HMGB1具有重要作用。在慢性牙周炎患者的病變牙齦組織中，同樣可以見到HMGB1自細胞核移位至細胞質，甚至到細胞外的情況；牙周炎病變牙齒的齦溝液內HMGB1的含量明顯高于正常牙齒。這些結果均提示細胞外的HMGB1作為一種晚期炎癥因子，可能在牙周炎的病理進程中起作用。

盡管多種細胞，如血管內皮細胞[13]、上皮細胞[14]、單核巨噬細胞[1]等，均已被發現可在炎癥環境中釋放

HMGB1，但單核巨噬細胞仍被認為是細胞外HMGB1的主要來源。慢性牙周炎的主要病理特點是局部病變區域中大量免疫活性細胞如粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等的遷移和浸潤。這些局部浸潤的免疫活性細胞在細菌及其LPS的作用下，可分泌大量炎癥因子，當然這些浸潤的細胞同樣會成為HMGB1的來源。在慢性牙周炎的牙齦組織中，可以見到上皮釘突下方大量白細胞浸潤，這些細胞的HMGB1已由細胞核轉移至細胞質甚至細胞外。與健康牙齦相比，慢性牙周炎患者齦溝液的HMGB1表達量也明顯升高。這些結果顯示：HMGB1是一種具有較高活動性的蛋白質，在炎癥環境下，可以自細胞核穿梭至細胞質并最終釋放至齦溝液內。

牙周炎是危害口腔健康的主要疾病之一，盡管目前對其病因和病理發生機制有了進一步的認識，多種炎癥因子在其發展進程中的作用亦得到較廣泛的研究，然而目前尚無有效的治療手段。本研究結果顯示：人PBMC在細菌LPS的刺激下可以釋放HMGB1，且HMGB1可與TNF-α形成增強放大環路，加速炎癥反應進程。在慢性牙周炎局部組織大量浸潤的單核巨噬細胞中，HMGB1自細胞核移位至細胞質中，甚至細胞外，并最終釋放至齦溝液內。HMGB1可能在慢性牙周炎的病理進程中具有重要作用，探討HMGB1的作用將為牙周炎的治療提供新的思路。

致謝：感謝德國海德堡大學曼海姆醫院Benito Yard教授的大力幫助，本研究中牙齦組織切片的免疫組織化學染色在海德堡大學曼海姆醫院實驗中心完成。

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（本文編輯 吳愛華）