基于氣相色譜-質譜聯用對櫻桃酒香氣分析

何蘭蘭，張 妮，于海燕，*

(1.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海201418;2.上海德諾產品檢測有限公司，上海200436)

櫻桃酒的香氣是由醇、酸、酯、醛、酮、芳香族和單萜類等多種物質的香氣復合組成，主要來自櫻桃果實本身、酵母代謝和陳釀［1］。明確產品的香氣特征能更好地完善產品品質，從而獲得消費者的認可。國內外對酸櫻桃加工和甜櫻桃的香氣成分做了研究，如Girard 等［2］認為己醛、2－己烯醛、2－己烯－1－醇、苯甲醛是甜櫻桃果實最重要的香氣成分;Peterse［3］和Poll［4］采用溶劑萃取法對酸櫻桃的香氣成分進行了初步研究;張序等［5］采用頂空固相微萃取(HSSPME)研究了‘紅燈’甜櫻桃果實發育過程中香氣成分組成及變化;張艷［6］采用 HS－SPME 結合 GC－MS分析中國櫻桃果實、果酒香氣成分，找出了櫻桃酒果香的主要物質為苯甲醛、乙酸乙酯等，酒香及醇香主要物質為苯甲醇、乙酸卞酯等。食品中香氣組分復雜、含量甚微，影響大、穩定性差，容易被破壞［7］。因而要求儀器具有較高的靈敏度，而目前儀器無法達到人類嗅覺靈敏，需對樣品進行前處理，使香氣物質濃度滿足分析和鑒定的要求。常用的香氣提取方法有:固相微萃取法［8］、頂空［9］、同時蒸餾萃取法［10－11］、液液 萃 取［12］、吹掃 捕 集 法［12］、攪 拌 棒 吸 附 萃 取法［13－14］、水蒸汽蒸餾法［15］等等。每一種提取方法都有各自的優缺點［16－17］，需根據樣品特性選擇最適提取方法。本實驗通過對比分析液液萃取、同時蒸餾萃取、水蒸汽蒸餾萃取和頂空固相微萃取對櫻桃酒香氣提取的影響，從而建立一種快速、簡單、準確的提取櫻桃酒中香氣方法;采用最優香氣提取方法結合GC－MS對不同品種、不同釀造年份的櫻桃酒香氣進行對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2009年中櫻狄墨爾櫻桃酒 山東尊皇櫻桃酒業科技有限公司;2008年櫻紅干酒、2009年櫻紅干酒、2010年櫻紅干酒、2009年櫻紅半干酒、2009年櫻紅半甜酒、2009年櫻紅甜冰酒、2009年櫻紅甜露酒 煙臺萊州櫻紅酒業有限公司;2－辛醇(純度為99%)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;C6～C24正構烷烴 Sigma－Aldrich公司，色譜純;氯化鈉、無水硫酸鈉、二氯甲烷、無水乙醇 上海國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司;MPS2固相微萃取自動進樣器 德國Gerstel公司;RE－52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SHB－IIIA循環水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司;DC－12型氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司;氣相色譜質譜聯用儀(GC 6890－MS 5973N) 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香氣提取方法

1.2.1.1 液液萃取(LLE) 取50mL 2009年中櫻狄墨爾櫻桃酒至500mL分液漏斗中，加入100μL內標2－辛醇(400mg/L)，50mL二氯甲烷分三次萃取(20、20、10mL)，靜置分層，分離合并三次有機相，加入無水Na2SO4干燥，冰箱過夜;過濾除去Na2SO4后旋轉蒸發濃縮至約1mL，氮吹儀濃縮至500μL，供GC－MS分析。

1.2.1.2 水蒸氣蒸餾萃取(VDE) 取50mL 2009年中櫻狄墨爾櫻桃酒至500mL圓底燒瓶中，加入100μL內標 2－辛醇(400mg/L)，蒸汽吹掃，冷凝器(冷凝水)連續收集。真空泵和冷凝器之間增加低溫冷凝器(－20℃)，接樣瓶中蒸餾溶液為50mL時結束蒸餾;取50mL蒸餾液用50mL二氯甲烷進行萃取，操作同液液萃取。

1.2.1.3 同時蒸餾萃取(SDE) 取50mL 2009年中櫻狄墨爾櫻桃酒至500mL圓底燒瓶中，加入100mL去離子水和100μL內標2－辛醇(400mg/L)，放入玻璃珠，置于SDE裝置的一端，電熱套加熱(70℃以下);另一端100mL圓底燒瓶中裝50mL二氯甲烷，45℃水浴加熱，提取2h;取50mL提取液加無水Na2SO4干燥，冰箱過夜;過濾除去Na2SO4后旋轉蒸發濃縮至約1mL，氮吹儀濃縮至500μL，供GC－MS分析。

1.2.1.4 頂空固相微萃取(HS－SPME)8mL 2009年中櫻狄墨爾櫻桃酒至裝有磁力攪拌子的20mL頂空瓶中，加入0.80g NaCl，10μL 內標2－辛醇(400mg/L)，插入萃取頭，55℃萃取30min。

1.2.2 實驗條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent HP－INNOWax(60m ×250μm ×0.25μm);程序升溫:初始溫度35℃，保留3min，以2℃/min的速率升至60℃，再以3.5℃/min的速率升至230℃，保留5min;進樣口溫度250℃;檢測器(MSD)溫度 250℃;載氣 He，流速1mL/min。HS－SPME法不分流自動進樣，溶劑延遲3min，解析5min;溶劑萃取法分流手動進樣，分流比20∶1，進樣1μL。

1.2.2.2 質譜條件 接口溫度250℃;離子源溫度230℃;EI電離源，電子能量 70eV;掃描范圍20～450amu。

1.3 香氣物質的定性、定量

香氣物質的定性采用譜庫(NIST05a.l、WILEY7n.l)檢索、并與文獻報道的保留指數(RI)對比確定所檢出化合物。保留指數(RI)是根據改進的Kovats法計算得出的，將 C6～C24的烷烴標樣進入GC－MS分離分析，利用得到的烷烴保留時間計算出檢出物質的保留指數。計算公式如下:

其中tRi為待測組分i的保留時間，tRZ和tR(z+1)為緊鄰香氣成分i前后的兩個正構烷烴的保留時間，z為正構烷烴的碳原子數。

采用內標法對香氣物質進行定量(假定校正因子為1)，計算公式Xi=(Ai/As)×Cs，其中:Xi為待測物質含量;Cs為櫻桃酒中內標物(2－辛醇)濃度;As為內標物的峰面積;Ai為待測物的峰面積。

2 結果與分析

2.1 四種萃取方法對比分析結果

四種萃取方法萃取的樣品經GC－MS分析的總離子流色譜圖見圖1，圖中橫坐標代表出峰時間，縱坐標代表離子強度。

從表1看出，HS－SPME分析的化合物總個數最少，物質總含量最低，為42.299mg/L;1－己醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸乙基3－甲基丁酯、水楊酸甲酯、苯乙酸乙酯、4－甲氧基苯甲醇甲酸酯、dl－檸檬烯、異松油烯、L－芳樟醇、苯酚、2，4－二叔丁基苯酚、乙氧基乙烯等物質只在HS－SPME方法中檢測到，其他三種方法中均未檢測到;HS－SPME萃取到的乙酸乙酯、山梨酸乙酯、苯甲醛、苯甲酸乙酯、α－松油醇含量最高，分別高達 3.737、3.488、3.586、3.633、0.237mg/L，其余三種方法檢測到的乙酸乙酯的含量僅為0.029～0.232mg/L;LLE、VDE、SDE三種方法萃取的化合物個數相近，物質種類也較為接近，其中LLE萃取到的酯類和芳香族物質的含量最多，分別高達128.343mg/L 和 1618.452mg/L。LLE、VDE、SDE 均屬于溶劑萃取法，繁瑣、耗時，需要的樣品量大，消耗大量的溶劑，且容易導致低沸點化合物的損失。HS－SPME提取到的香氣化合物種類最少，但它將萃取、脫附、進樣結合在一起，具有樣品無需要前處理、不需溶劑、樣品用量少、分析時間短等優點［18］，適合快速對大批量樣品進行分析。

圖1 HS－SPME、LLE、VDE和SDE所得揮發性物質的GC－MS總離子流色譜圖Fig.1 GC－MS total ion chromatogram of volatile components by HS－SPME，LLE，VDE and SDE.

表1 四種方法萃取櫻桃酒中香氣成分含量比較Table 1 Comparison of cherry wine aromas by four different extraction methods

續表

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2.2 櫻桃酒香氣成分定量分析

通過HS－SPME萃取櫻桃酒中香氣物質，對櫻桃酒中84種香氣物質進行了定量分析，包括13種醇類化合物、7種脂肪酸類化合物、21種酯類化合物、6種醛酮類化合物、16種芳香族化合物、9種單萜類化合物、5種酚類化合物、4種呋喃類化合物、3種其它類化合物。7種市售櫻桃酒中的香氣物質含量見表2。

從香氣物質總含量上看，S－09－Ice揮發性香氣成分含量最高(33.525mg/L)，含量最少的是 D－09(16.126mg/L);在三種不同年份的干型櫻桃酒中，D－10櫻桃酒中揮發性香氣成分含量最高(23.686mg/L)，其次是 D－08(19.141mg/L)。

醇類:醇類物質是酒中主要香氣物質，主要是由糖代謝、氨基酸脫羧和脫氫產生［19］。醇類總含量最高的是 D－10(8.444mg/L)，含量最低的是 S－09－Ice(3.843mg/L)。七種櫻桃酒中醇類物質含量較高的是異戊醇、1－己醇和1－丙醇，其中異戊醇的含量最高，濃度范圍為 1.202～6.036mg/L。D－08、D－09 和SD－09中排名二、三位的是1－己醇、1－丙醇;SW－09、S－09－Ice、S－09－Liqueur中排名第二位的是2－丁醇，1－丙醇、1－己醇次之。異戊醇、1－己醇、1－丙醇、2－丁醇是櫻桃酒中最主要的醇類物質。

脂肪酸類:脂肪酸是酒的重要協調成分，酸是酒精和乳酸發酵過程產生的［20］。脂肪酸總含量最高的是SW－09(3.176mg/L)，D－09最低(0.730mg/L)。七種櫻桃酒的共性酸是乙酸、己酸、辛酸。從單個揮發酸來看，乙酸是 SD－09、SW－09、S－09－Ice、S－09－Liqueur中含量最高，占總測定的脂肪酸類含量的49.33%～68.60%，遠遠高于其它脂肪酸類香氣物質。D－08、D－09、D－10 中含量最高的是辛酸，濃度分別為 0.386、0.368、0.439mg/L，分別占總測定脂肪酸含量的39.59%、50.38%、43.28%;其次是乙酸，濃度分別為 0.158、0.135、0.167mg/L。

表2 七種櫻桃酒揮發性成分種類與含量Table 2 Varieties and content of volatile compounds of 7 cherry wine samples

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酯類:酯類主要來源于果實、發酵過程中乙醇酯化和陳釀［21］，絕大多數酯類使酒具有花果香。SW－09中酯類物質比 D－09、D－08、SD－09中高出 2～5倍;SW－09、S－09－Ice酯類總含量明顯大于其它幾種酒，總含量分別為15.502、14.461mg/L，其中含量最高的是乙酸乙酯，濃度分別為 11.999mg/L和11.349mg/L;D－08和D－10中含量最高的是辛酸乙酯，分別為1.407mg/L和2.563mg/L。

醛酮類:七種櫻桃酒都存在的是乙醛，濃度范圍為0.028～0.054mg/L;含量最高的是SW－09中(3E，5E)－3，5－庚二烯－2－酮(0.091mg/L);其余4 種醛酮類只在個別酒中存在。SW－09、S－09－Ice中醛、酮類化合物總含量相近，含量也最高。

芳香族類:芳香族化合物能賦予酒醇厚、優雅的香氣，其含量在七種櫻桃酒濃度范圍為4.348～10.749mg/L。S－09－Liqueur中芳香族化合物所占比例高于其他6種櫻桃酒為41.47%。16種芳香族化合物中，苯甲醛、苯甲酸乙酯、苯甲醇、苯乙醇等物質含量相對較高，其中苯甲醛含量最多。櫻桃酒中苯甲醇含量也較高，濃度范圍為 1.209～1.640mg/L(S－09－Liqueur除外，濃度僅為0.537mg/L)。

單萜類:共檢測到9種單萜類化合物，總含量在0.265～0.773mg/L。其中 dl－檸檬烯、L－芳樟醇、α－松油醇在7種酒樣中均有檢測到，香葉醇除了在S－09－Liqueur中未檢測到外，其它6種櫻桃酒中均有檢測到;而蒈烯只在 D－08中檢測到，濃度為0.027mg/L。

酚類、呋喃類、其它類化合物:共檢測到5種酚類化合物，總含量范圍為0.092～0.706mg/L，其中只有2，4－二叔丁基苯酚在七種酒樣中均有檢測到。4種呋喃類化合物中，只有糠醛在七種櫻桃酒中均存在，且含量最高，濃度范圍為0.095～0.253mg/L。乙氧基乙烯在7種櫻桃酒中均有檢測到，但濃度較低;2－甲基－1，3－二氧己環僅存在于 SW－09、S－09－Ice中，且含量較高，分別為0.135、0.228mg/L。

3 結論

HS－SPME法不需要溶劑，所需樣品量少，操作簡單、快速、方便，適合對大批量樣品進行快速準確分析。七種櫻桃酒中2009年櫻紅甜冰酒揮發性香氣成分含量最高，含量最少的是2009年櫻紅干酒;三種不同年份的干型櫻桃酒中，2010年櫻紅干酒中揮發性香氣成分含量最高，其次是2008年櫻紅干酒;同是甜型酒，采用“低溫CO2浸漬發酵”無法避免會帶入一些揮發性香氣物質進入酒體，香氣物質總含量也就比其它采用傳統方法發酵的櫻桃酒多;同一年份，干型、半干型、半甜型、甜型這四種不同酒型的櫻桃酒，其香氣物質各具特色。

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