新疆蒙古族和哈薩克族傳統乳制品中乳酸菌多樣性的比較

董曉婉，李寶坤，李開雄，盧世玲，郭素娟，彭小麗

(石河子大學食品學院，新疆石河子832003)

新疆是個多民族居住的地區，在這里的少數民族一直都有食用自制發酵乳制品的習慣。這種傳統發酵乳制品風味獨特，營養價值高，具有較好的益生作用［1］，同時富含了當地自然環境中豐富的微生物資源，乳酸菌是其中微生物的重要組成部分。它具有維持腸道菌群的生態平衡，降低血清膽固醇、抗氧化、防癌和抗癌等作用［2－4］。有研究發現［5］，從傳統奶制品中分離到的乳酸菌具有強烈的抑菌特性，可以在發酵過程中抑制其他有害于奶制品生產和風味的細菌的生長。新疆的地理位置非常獨特，北有阿爾泰山，中有天山，南有昆侖山，其間夾有兩個大盆地－準噶爾盆地和塔里木盆地。其氣候屬溫帶大陸性干旱氣候，它的年溫差、日溫差極大，降水和氣溫的地區差異和垂直差異也非常顯著［6］。這種獨特的地理和氣候條件對傳統乳制品中微生物菌群結構和種類也產生了一定的影響。目前，國內外學者對傳統乳制品中乳酸菌的研究雖然比較全面，但是其大多采用傳統分離鑒定方法或現代分子生物學方法，而將兩種方法相結合對其進行研究的還不是很多，本文通過革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗等傳統分離方法對新疆準噶爾盆地西北部和布克賽爾縣的17份哈薩克族酸奶樣品及8份蒙古族酸奶樣品中的乳酸菌進行了分離鑒定，同時選取代表菌株進行16S rDNA基因序列分析，并將兩種方法的結果相結合，確定菌株類型及不同樣品中菌株的差異，對菌株進行較為全面、準確的鑒定，為新疆傳統乳制品中乳酸菌的多樣性及不同民族傳統酸奶中乳酸菌的差異性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

25份酸奶樣品 采集自新疆和布克賽爾縣傳統工藝制造酸奶的牧民家庭，其中哈薩克族為17份，蒙古族為8份。采集的酸奶裝于滅菌的離心管內，封嚴后放入車載冰箱于4℃運至實驗室，即進行后續實驗;Lb.plantarum(植物乳桿菌)、Lactococcus lactis(乳酸乳球菌) 均為實驗室保存菌種。

電熱恒溫培養箱(DNP－9272) 上海精宏實驗設備公司;高速冷凍離心機(5417R)Eppendorf公司;PCR擴增儀(TC－512)Techne公司;熒光電子顯微鏡(DM3000) Lecia公司;電熱蒸汽滅菌器(LD2X－40II) 上海申安醫療器械廠。

MRS培養，硝酸鹽還原實驗培養基、明膠液化實驗、H2S實驗、葡萄糖產氣實驗等培養基參照東秀株等編著的《常見細菌系統鑒定手冊》和凌代文編著的《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中所介紹的方法配制。

1.2 乳酸菌的分離純化

將酸奶樣品用0.9%滅菌生理鹽水做10倍遞增稀釋，取 10－2、10－3、10－4三個稀釋度，分別吸取200μL于MRS平板培養上涂布，置于培養箱中37℃培養36～48h。根據菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等，挑取單菌落，分別在MRS固體培養基上反復劃線分離，直至菌落較純。進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體大小、形狀、排列方式，同時進行過氧化氫酶實驗，將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步認定為乳酸菌［7］。將純菌進行斜面保藏用于近期實驗。同時用40%甘油保菌，置于－20℃冰箱中保存備用。

1.3 屬種的鑒定實驗

將初步確定為乳酸菌的菌株按照圖1的鑒定程序區分不同的乳酸菌菌屬，再通過分離菌株對碳水化合物的發酵產酸實驗，即利用細菌微量生化反應管，將活化好的菌液離心后，用生理鹽水重新懸浮，注入管內，再放入滅菌大試管中，37℃培養一周后觀察結果。通過對單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來對種進行鑒定［8－9］。

1.4 16S rDNA基因序列分析

1.4.1 DNA的提取 應用GenElute TM細菌總DNA提取試劑盒提取樣品中所分離出的乳酸菌菌株的總DNA，按說明書操作。

1.4.2 16S rDNA基因序列的測定 應用細菌16S rDNA基因通用引物對細菌16S rDNA的V6～V8區段進行PCR擴增。上游引物為U968(5′－AAC GCG AAG AAC CTT AC－3′);下游引物為 L1401(5′－CGG TGT GTA CAA GAC CC－3′)［10］。PCR 反應體系為25μL，引物各 1μL，1μL 的 DNA 稀釋液，預混液12.5μL，補充9.5μL ddH2O 至終體積為25μL。

圖1 乳酸菌屬鑒定程序Fig.1 Identification procedure of Lactobacillus

PCR擴增程序:94℃預變性4min，20個循環(94℃變性30s，退火溫度從65℃到55℃，退火30s，72℃延伸30s)，再于恒定的退火溫度下進行10個循環(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最終72℃延伸10min。

1.4.3 同源性分析 采用MEGA5.0中的鄰接法(Neighbour－joining)將測序所得序列及NCBI中獲得的參比菌株的16S rDNA基因序列進行系統發育樹的構建，自展值(bootstrap)為1000。

2 結果與分析

2.1 分離菌株形態及細胞形態

通過傳統培養分離及圖1的乳酸菌鑒定表，25份酸奶樣品共分離出42株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的桿菌和球菌。分離的菌株菌落多為在培養基表面生長的表面光滑、邊緣整齊、中央有凸起或扁平的白色或半透明狀菌落，或者邊緣不整齊、表面粗糙無光澤和中央有凸起或扁平的乳黃色菌落。分離的桿菌細胞形態為長桿狀或短桿狀，多數呈鏈狀排列。球菌呈圓形或卵圓形，一般以單個、成對或鏈狀排列(如圖2)。

圖2 分離菌株的革蘭氏染色熒光顯微鏡圖片Fig.2 The images of fluorescence microscope from isolates of gram staining

2.2 乳酸桿菌屬、種的鑒定結果

實驗以Lb.plantarum(植物乳桿菌)作為對照菌株。把所分離到的14株無芽孢革蘭氏染色陽性、接觸酶和H2S實驗均為陰性、不還原硝酸鹽、不液化明膠、不運動的桿菌，鑒定為乳桿菌屬(表1)。

14株乳桿菌中有3株不發酵苦杏仁苷、七葉靈、甘露醇、松三糖、鼠李糖、水楊苷和山梨醇與Lb.fermentum(發酵乳桿菌)性質相近，故鑒定為Lb.fermentum(發酵乳桿菌)。

表1 分離自新疆酸奶中的乳酸菌的生理特性Table 1 Physiological characteristics of the lactic acid bacteria isolated from fermented dairy products collected in Xinjiang

9株乳桿菌不能利用鼠李糖，能夠發酵苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖等大多數糖類，鑒定為Lb.plantarum(植物乳桿菌)。

1株乳桿菌能利用松三糖、水楊苷產酸，不能從阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、鼠李糖、棉子糖產酸，與Lactobacillus casei(干酪乳桿菌)的性質相近。

1株未知。

2.3 乳酸球菌屬、種的鑒定結果

實驗采用Lac.lactis(乳酸乳球菌)作為對照菌株，把分離出的28株無芽孢、革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶反應陰性的球菌，進行屬的鑒定，得到片球菌21株，腸球菌6株，1株未知(表1)。

21株片球菌能夠發酵核糖和木糖，不能利用麥芽三糖、松三糖、蔗糖等，且能生長在45℃的環境下，與P.acidilactici(乳酸片球菌)性質相似。

6株腸球菌均能從蜜二糖、甘露醇產酸，不從山梨醇、松三糖產酸，初步確定為Enterococcus faecium(屎腸球菌)。

2.4 序列分析和系統發育樹的構建

從蒙古族和哈薩克族酸奶樣品中各挑選了9株長勢較好，菌落大小、顏色、形態不同的菌株作為代表菌株進行16S rDNA基因序列測定，構建了18乳酸菌和部分相關種模式株16S rDNA基因序列在內的系統發育樹(圖3)，由系統發育樹可知18株菌分屬于4個屬，它們分別是乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)。菌株 H5－1、H5－2、H1－1、H8－1、H2－1、H17－1、M2－2、M4－1、M8－2 隸屬于乳桿菌屬，其中菌株 H1－1、H8－1與 Lb.fermentium(發酵乳桿菌)系統發育關系最近，菌株 H5－1、H17－1、M2－2、M4－1和M8－2在系統發育上與Lb.plantarum(植物乳桿菌)處于同一分支，菌株 H2－1與Lb.crustorum(面包乳桿菌)的序列同源性為100%，菌株H5－2與Lb.paracasei(類干酪乳桿菌)的序列同源性最高。菌株 M1－1、M6－1、M8－1 和H1－2 與 P.acidilactici(乳酸片球菌)序列相似性最高。菌株M3－1屬于魏斯氏屬，與 W.cibaria處于同一個分支。M2－3、H13－1、M7－2、H9－2與E.durans(耐久腸球菌)系統發育關系最近。這18株與相關模式菌株的16S rDNA基因序列同源性均高達99%及以上，從而證明各代表菌株與模式菌株為同一種菌。

圖3 分離乳酸菌菌株和相關菌株16S rDNA基因序列建立的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree establishment of separation Lactobacillus and relation strain 16S rDNA gene sequences

2.5 分離菌株的綜合鑒定結果

通過實驗結果可以看出，16S rDNA基因序列鑒定結果能夠較好地與生理生化結果相吻合，經16S rDNA基因序列鑒定的18株代表菌株中已確定的4株P.acidilactici(乳酸片球菌)、5株 Lb.plantarum(植物乳桿菌)和2株Lb.fermentum(發酵乳桿菌)與生理生化結果相符。經生理生化鑒定得出的1株Lb.casei(干酪乳桿菌)和1株 E.faecium(屎腸球菌)，通過16S rDNA基因序列鑒定結果分別為Lb.paracasei(類干酪乳桿菌)和E.durans(耐久腸球菌)且同源性在99%以上，故確定為Lb.paracasei(類干酪乳桿菌)和E.durans(耐久腸球菌)。通過生理生化鑒定未確定的2株菌株(1株球菌，1株桿菌)，經過16S rDNA基因序列鑒定結果確定為1株W.cibaria(食竇魏斯氏菌)，1株Lb.crustorum(面包乳桿菌)。

2.6 新疆同一地區不同民族自制酸奶中乳酸菌的分離情況

通過傳統的生理生化實驗以及16S rDNA基因序列鑒定結果可以得出從新疆和布克賽爾采集的25份酸奶樣品共分離出42株乳酸菌。其中8份蒙古族樣品共分離出12株乳酸菌，17份哈薩克樣品中共分離出30株乳酸菌(如表2)。

蒙古族酸奶樣品分離的乳酸菌有:P.acidilactici(乳酸片球菌)5株、E.durans(耐久腸球菌)3株、Lb.plantarum(植物乳桿菌)3株、W.cibaria(食竇魏斯氏菌)1株，其中P.acidilactici(乳酸片球菌)為優勢菌(占總分離的41.7%)，其次是 E.durans(耐久腸球菌)和Lb.plantarum(植物乳桿菌)(均占分離菌總數的25%)。

哈薩克酸奶樣品分離的乳酸菌有:P.acidilactici(乳酸片球菌)16株、Lb.plantarum(植物乳桿菌)6株、E.durans(耐久腸球菌)3株、Lb.fermentum(發酵乳桿菌)3株、Lb.paracasei(類干酪乳桿菌)1株，Lb.crustorum(面包乳桿菌)1株，其中P.acidilactici(乳酸片球菌)為優勢菌(占總分離的50%)，其次是L.plantarum(植物乳桿菌)(占總分離的20%)。

表2 新疆和布克賽爾縣不同民族傳統乳制品中乳酸菌的分離情況Table 2 The separation of lactic acid bacteria in traditional dairy products from different minority in xinjiang

3 結論

從新疆和布克賽爾縣采集的25份酸奶樣品共分離出42株乳酸菌。其中8份蒙古族樣品共分離出12株乳酸菌，17份哈薩克樣品中共分離出30株乳酸菌。

如表2所示:新疆和布克賽爾縣的蒙古族和哈薩克族傳統酸奶分離出的乳酸菌構成比例相差不大，優勢菌群均為P.acidilactici(乳酸片球菌)，且都分離出了E.durans(耐久腸球菌)和Lb.plantarum(植物乳桿菌)。但是兩種民族酸奶樣品中的乳酸菌菌群還是有一定的差異性。蒙古族樣品分離出的桿菌數量較少(僅占分離總數的25%)，且種類單一(只有3株Lb.plantarum(植物乳桿菌))，哈薩克族樣品中分離出的Lb.fermentum(發酵乳桿菌)、Lb.paracasei(類干酪乳桿菌)和Lb.crustorum(面包乳桿菌)在蒙古族酸奶樣品中并未分離出來，哈薩克族酸奶樣品中除了P.acidilactici(乳酸片球菌)，其余分離出的菌種數量相差不大，除了W.cibaria(食竇魏斯氏菌)未被分離出外，蒙古族酸奶樣品中分離的所有菌種，均在哈薩克族酸奶樣品中分離出來。

趙蕊、霍貴成曾研究了新疆伊犁酸馬奶中乳酸菌的多樣性［11］，發現 Lactobacillus helveticus(瑞士乳桿菌)為優勢菌群，并且也分離出了Lb.plantarum(植物乳桿菌)、Lb.fermentum(發酵乳桿菌)和E.durans(耐久腸球菌);劉潔潔、李開雄等研究了新疆阿勒泰地區哈族傳統乳制品的多樣性［12］，分離出了Lb.Helveticus(瑞士乳桿菌)、Lb.casei(干酪乳桿菌)、Lb.fermentum(發酵乳桿菌)和 E.durans(耐久腸球菌)。其中Lb.Helveticus(瑞士乳桿菌)為優勢菌群。通過比較發現雖然優勢菌群不同，但菌群多樣性相似，Lb.plantarum(植物乳桿菌)、Lb.fermentum(發酵乳桿菌)和E.durans(耐久腸球菌)都曾被分離出來。

通過分析可以看出，同一地區不同民族酸奶樣品中菌群種類和數量略有差異，產生差異性的原因可能是:雖然生活在同一地區，但蒙古族和哈薩克族牧民長期形成的不同生活習慣和飲食偏好習慣以及傳統乳制品制造工藝不同造成的。也正是這種差異性豐富了我國乳酸菌菌質資源。

本實驗對同一地區采集的不同民族酸奶樣品中分離純化的42株乳酸菌，進行了種屬的鑒定，對其生理生化特征作了初步研究，為新疆同一地區不同民族傳統乳制品中乳酸菌的多樣性提供了理論依據。

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