普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠抗氧化應(yīng)激作用的研究

王 蕊，肖 蓉，劉家奇，楊蘭蘭，劉文文，施瀚超，侯 艷，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，云南昆明650201;3.云南省昆明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明650000;4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明650201)

近年來(lái)，酒精已成為病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害 的第二大病因［1］。現(xiàn)代研究證實(shí)，普洱茶具有降脂、減肥、降壓、抗動(dòng)脈硬化;防癌、抗癌;養(yǎng)胃、護(hù)胃;健牙護(hù)齒;消炎、殺菌、治痢;抗衰老等作用［2－6］，普洱茶以其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是抗氧化效應(yīng)和降血脂、降血糖效應(yīng)，對(duì)于酒精性脂肪肝的防治顯示出誘人的應(yīng)用前景。細(xì)胞色素P450，是肝臟代謝最主要的酶系之一，其中細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)與酒精代謝密切相關(guān)，CYP2E1是細(xì)胞色素P450的乙醇誘導(dǎo)形式，它可催化乙醇產(chǎn)生過(guò)氧化物，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，在酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制中起重要作用［7］，細(xì)胞色素P4502E1是主要在肝臟表達(dá)的細(xì)胞色素P450重要的亞型，國(guó)內(nèi)對(duì)酒精性肝損傷的研究主要集中在氧化損傷方面，而參與氧化代謝的重要代謝酶亞型CYP2E1在酒精引起的酒精性肝損傷中的變化及作用環(huán)節(jié)尚未明確。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF－1)具有胰島素樣作用，對(duì)糖、脂代謝的作用與胰島素有類似之處，IGF－1能改善肝功能，減輕肝臟氧化損傷［8－9］，動(dòng)物試驗(yàn)提示低劑量 IGF－1 有抗肝纖維化作用［10］，在一定程度上 IGF－1水平可以反映肝臟細(xì)胞的活性。肝臟是合成IGF－1的主要場(chǎng)所，如果肝細(xì)胞受損則IGF－1表達(dá)降低，已有報(bào)道IGF－I在肝硬化患者中的含量明顯下降，但它與酒精性脂肪肝的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，本試驗(yàn)選取與預(yù)防肝細(xì)胞氧化損傷關(guān)系密切的CYP2E1、IGF－1為分子靶點(diǎn)，同時(shí)測(cè)定肝組織中的抗氧化指標(biāo)、血清血脂指標(biāo)及胰島素水平，探索普洱茶對(duì)酒精性肝組織損傷的分子機(jī)制及普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠抗氧化應(yīng)激作用的影響，為普洱茶作為防治肝臟疾病的藥物原料或保健食品的開(kāi)發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍潤(rùn)普洱茶熟茶(2007年10月) 云南云縣天龍生態(tài)茶葉有限責(zé)任公司生產(chǎn)(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào):DB53/103－2007);版納普洱熟茶(2007年7月) 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，西雙版納普洱茶研究院(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)代號(hào):DB53/103);帕卡普洱熟茶(2007年5月) 云南省思茅茶樹(shù)良種場(chǎng)，中國(guó)普洱茶研究院(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)代碼:DB53/103)，將上述茶樣按1∶1∶1等量混合制成受試茶樣;藥物組藥品 市售某保肝藥物;活性氧(ROS)、胰島素(INS)試劑盒 北京奇松生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－PX)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;SPF級(jí)Wistar雄性大鼠(180～220g) 由北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(批號(hào):SCXK(京)2012－0001);動(dòng)物飼料 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)成分及能量組成如表1。

L－3280半自動(dòng)生化分析儀 上海科華試驗(yàn)系統(tǒng)有限公司生產(chǎn);7900HT熒光定量PCR儀 新加坡制造;Epppendorf－4910單道微量可調(diào)移液器 德國(guó)Epppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 茶湯制備方法 普洱茶(熟茶)磨碎后制備茶湯，制備方法參照文獻(xiàn)［5］。提取的茶湯終濃度為1g/mL，滅菌后置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 根據(jù)所評(píng)價(jià)的功能性試驗(yàn)動(dòng)物要求，選用外形符合健康標(biāo)準(zhǔn)，體重在180～220g之間的SPF級(jí)Wistar雄性大鼠為試驗(yàn)對(duì)象。觀察喂養(yǎng)3d后，剔除不合格鼠，按體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物組，普洱茶(熟茶)低、中、高劑量組，每組10只，共60只。陰性對(duì)照組每天飼喂陰性對(duì)照組液體飼料，其他各組大鼠均飼喂試驗(yàn)組飼料，每天定時(shí)經(jīng)口灌胃受試樣品。普洱茶組給予不同劑量普洱熟茶(低、中、高劑量分別為人體推薦攝入量的5、10、20 倍，即 0.5、1.0、2.0g/kg·bw)，藥物組灌胃藥品(0.15g/kg·bw)［11］，一次經(jīng)口灌胃 2mL/d，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組均灌胃等體積的蒸餾水。

表1 動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)成分及能量組成表Table 1 Nutritional composition and energr of feed

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)管理 大鼠同室單籠飼養(yǎng)，采用液體飼料飼喂，每天晚上定時(shí)更換飼料并記錄大鼠攝食量，環(huán)境溫度控制在(20±2)℃，濕度45%～60%。籠具、墊料舒適、衛(wèi)生、無(wú)毒、安全，飼養(yǎng)房間定時(shí)用消毒劑消毒，房間定時(shí)通風(fēng)，使其保持一個(gè)良好的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)與方法 試驗(yàn)第60d，大鼠12h禁食不禁水，股動(dòng)脈采血，分離血清，測(cè)定血清中 TG、FFA、INS水平，犧牲大鼠后，摘取肝組織，制備10%的肝臟勻漿，測(cè)定肝組織中ROS、SOD、GSH－Px活性及MDA含量;檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

RNA提取和 RT－PCR:肝臟總 RNA的提取和cDNA的合成分別用 TRIZOL和TAKARA(Code:DRR047A)試劑盒按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟操作。PCR引物序列:R－CYP2E1:CAAGGCTGTCAAGGAGG TGCTACTG，GCTTAGGGAAAACCTCCGCACATCC;

R－IGF－1:AGCGCCACACTGACATGCCC，GGATCTTGCGGTGACGTGGC;

內(nèi)參照 Gapdh:GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT，AACCAGGCGTCCGATACGGC。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠體重的影響

表2顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠體重和體重凈增值顯著下降(p＜0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，普洱茶高劑量組大鼠體重和體重凈增值顯著下降(p＜0.05，p＜0.01)。

表2 普洱茶對(duì)Wistar大鼠體重的影響Table 2 The influence of Pu－erh tea on the body weight in wistar rats

表3 普洱茶對(duì)大鼠肝組織GSH－PX、ROS|、SOD活性、MDA含量的影響Table 3 The influence of fermented Pu－erh tea on liver tissue levels of GSH－Px、SOD、ROS and MDA in wistar rats

表4 普洱茶對(duì)大鼠血清INS活性、FFA、TG含量的影響Table 4 The influence of Fermented Pu－erh tea on serum levels of INS、FFA、TG in wistar rats

2.2 普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝組織GSH－PX、ROS、SOD活性、MDA含量的影響

表3顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織GSH－PX活性顯著下降(p＜0.01);SOD活性有所下降，但差異不顯著(p＞0.05);ROS活性、MDA含量顯著升高(p＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，普洱茶高劑量組和藥物組大鼠肝組織GSH－PX活力、中、高劑量組大鼠肝組織SOD活性顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);普洱茶中、高劑量組和藥物組大鼠肝組織ROS活性、高劑量組大鼠肝組織MDA含量顯著下降(p＜0.05，p＜0.01)。

2.3 普洱茶對(duì)大鼠血清INS活性、FFA、TG含量含量的影響

表4顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組血清INS水平和FFA、TG含量顯著上升(p＜0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，普洱茶低、中、高劑量組及藥物組大鼠血清 INS活力、TG含量顯著下降(p＜0.05，p＜0.01);普洱茶中、高劑量組與藥物組大鼠血清FFA含量顯著下降(p＜0.01)。

2.4 普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1、IGF－1基因表達(dá)的影響

表5顯示，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織CYP2E1基因表達(dá)量上升，但差異不顯著(p＞0.05)，IGF－1基因表達(dá)顯著下降(p＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，普洱茶高劑量組CYP2E1基因表達(dá)量顯著下降(p＜0.05)。IGF－1基因表達(dá)顯著上升(p＜0.05)。

表5 普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1及IGF－1基因表達(dá)的影響Table 5 The influence of Fermented Pu－erh tea on Gene expression quantity of CYP2E1 and IGF－1 in rats with alcoholic fatty liver

3 討論

3.1 普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1基因表達(dá)的影響

細(xì)胞色素P450，是一組相對(duì)非特異性酶，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，但主要存在于肝細(xì)胞微粒體上，是肝臟代謝最主要的酶系之一，是參與藥物代謝及身體其他外來(lái)物質(zhì)代謝作用重要的酶。其中細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)與酒精代謝密切相關(guān)，CYP2E1是細(xì)胞色素P450的乙醇誘導(dǎo)形式，它在非乙醇脫氫酶氧化途徑中起重要作用，為酒精性肝病的主要發(fā)病機(jī)制［12］。CYP2E1在酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制中主要參與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，與ROS生成有關(guān)。酒精在肝細(xì)胞內(nèi)通過(guò)細(xì)胞色素CYP2E1并在鐵離子參與下的氧化作用，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，如·OH－、O2－·、H2O2等自由基，這些活性氧自由基可激活磷脂酶及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低膜磷脂，改變其通透性和流動(dòng)性，從而改變與膜結(jié)合的酶、受體和離子通道的微環(huán)境，影響其功能，還可以刺激肝星狀細(xì)胞分泌膠原，最終導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生［13］。此外，乙醇的攝入可誘導(dǎo)CYP2E1基因的表達(dá)，CYP2E1具有很強(qiáng)的氧化活性，能將乙醇氧化生成乙醛，產(chǎn)生大量活性氧中間產(chǎn)物并激活Kupffer細(xì)胞釋放炎癥因子，使ROS增多;隨著CYP2E1表達(dá)的增強(qiáng)，體內(nèi)清除ROS自由基的SOD、GSH－PX含量均顯著下降。由于脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的增強(qiáng)而抗氧化能力的下降，導(dǎo)致ROS的生成增多，進(jìn)一步促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使MDA生成增加，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損害。另外還發(fā)現(xiàn)，自由基可以在肝細(xì)胞膜上與CYP2E1結(jié)合引起抗體依賴的細(xì)胞毒作用，使肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致酒精性肝病的病理變化。

本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示:RT－PCR方法測(cè)定CYP2E1mRNA表達(dá)說(shuō)明，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織中CYP2E1基因表達(dá)上升，ROS活性、MDA含量顯著升高，肝組織中SOD和GSH－PX活力顯著下降，提示攝入酒精后會(huì)誘導(dǎo)CYP2E1表達(dá)上升，進(jìn)而導(dǎo)致ROS大量生成，從而加重酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，由此可知，CYP2E1基因的高表達(dá)與脂質(zhì)過(guò)氧化是脂肪肝發(fā)病過(guò)程中不可忽略的重要因素。給予普洱茶和受試藥物后，各試驗(yàn)組大鼠肝組織CYP2E1基因表達(dá)、ROS活性、MDA含量均下降，SOD和GSH－PX活力顯著升高，提示普洱茶可有效抑制酒精性脂肪肝大鼠肝組織CYP2E1基因表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

通過(guò)對(duì)抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)提示:普洱茶可能通過(guò)提高清除自由基的SOD和GSH－PX的活性，進(jìn)一步提高機(jī)體抗氧化的能力，進(jìn)而增強(qiáng)了脂質(zhì)代謝的能力，減緩了脂毒性，提高了機(jī)體防御和消除自由基的能力，降低機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而預(yù)防和減輕了酒精性脂肪肝的發(fā)生或發(fā)展。這可能與普洱茶含有多種生物活性成分有關(guān)。普洱茶中含有的茶多酚和茶多糖，具有結(jié)合自由基，抑制細(xì)胞色素參與親電子代謝物的形成，阻斷或減慢氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，防止機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化等作用［14］

3.2 普洱茶對(duì)酒精性脂肪肝大鼠肝組織IGF－1基因表達(dá)的影響

IGF－l是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。主要由肝細(xì)胞分泌，它具有廣泛的生理作用，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及代謝的調(diào)節(jié)有著重要的作用，IGF－1和胰島素有50%的序列相同，血液中的 IGF－l主要來(lái)源于肝臟的生物合成，在代謝方面IGF－1具有胰島素樣作用［15］，其中類似胰島素的代謝效應(yīng)主要表現(xiàn)為:促進(jìn)組織攝取葡萄糖，刺激糖原異生和糖酵解;促進(jìn)糖原合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪合成，抑制蛋白質(zhì)和脂肪分解，減少血液FFA和氨基酸的濃度。有研究表明IGF－1的表達(dá)能有效降低糖尿病動(dòng)物的血糖［16］;IGF－1在肝組織［17］對(duì)胰島素抵抗有保護(hù)作用，能改善肝功能，減輕肝臟氧化損傷［8－9］。

本研究試圖探討IGF－l對(duì)酒精性脂肪肝的影響，從而為臨床治療酒精性脂肪肝提供依據(jù)，結(jié)果表明，酒精性脂肪肝大鼠肝組織IGF－l基因表達(dá)顯著下降，考慮機(jī)制如下:IGF－l主要在肝臟合成，其合成受生長(zhǎng)激素(GH)的控制，稱為 GH－IGF－l軸，GH 與GH受體結(jié)合后在肝內(nèi)促進(jìn)IGF－l的基因轉(zhuǎn)錄［18］。當(dāng)肝臟嚴(yán)重受損時(shí)，肝細(xì)胞合成GH受體能力降低，肝細(xì)胞GH受體表達(dá)減少，從而使IGF－1表達(dá)減少。此外酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)血清FFA、TG、INS水平顯著上升，提示酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，胰島素水平異常。有研究表明，血循環(huán)中FFA濃度過(guò)高以及非脂肪細(xì)胞(主要是肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島β細(xì)胞)內(nèi)脂質(zhì)含量過(guò)多，可通過(guò)各種有關(guān)途徑導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，以及引起胰島β細(xì)胞性凋亡和分泌INS功能缺陷［19］，導(dǎo)致INS異常，本試驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。胰島素抵抗在脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［20－21］。有研究表明，外周胰島素抵抗可能使抑制激素敏感性脂肪酶的活性下降，外周脂肪組織分解增加，F(xiàn)FA水平升高，而FFA水平升高可加劇患者的胰島素抵抗［22］，這樣INS、FFA之間形成了一個(gè)惡性循環(huán)，加重肝細(xì)胞損傷。給予普洱茶后，IGF－l基因表達(dá)顯著上升，各試驗(yàn)組 INS水平和FFA、TG含量顯著下降，提示，普洱茶可有效促進(jìn)IGF－1基因的表達(dá)，大量的IGF－1有促使肝細(xì)胞增殖，加強(qiáng)肝臟的合成和代謝功能，從而促進(jìn)受損肝細(xì)胞恢復(fù)的作用。試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，隨著IGF－1基因表達(dá)量上升，各試驗(yàn)組FFA、TG含量顯著下降，這可能與IGF－1能加強(qiáng)代謝功能、改善肝功能、減輕肝臟氧化損傷、有效改善胰島素抵抗有關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述，本批次普洱茶(熟茶)在本試驗(yàn)條件下，可有效抑制酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)CYP2E1基因的表達(dá)，促進(jìn)IGF－1基因表達(dá)，進(jìn)而改善大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、有效降低大鼠血脂水平，改善胰島素抵抗，進(jìn)而起到了抗氧化應(yīng)激的作用，有效的預(yù)防了酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展。

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