HHEX基因rs1111875G/A多態性與妊娠糖尿病的關系

何明明，班 博，張 梅，李 萍，孫海玲，潘耀平，王艷萍

(1天津醫科大學研究生院，天津300070;2濟寧醫學院附屬醫院)

妊娠糖尿病 是指妊娠過程中發生或首次發現的任何程度的糖耐量異常，其發病機制涉及胰島素分泌缺陷及胰島素抵抗。目前認為其與2型糖尿病(T2DM)相似，亦是遺傳基因和環境因素共同作用的結果。T2DM家族史增加了妊娠婦女發生GDM的風險［1］，GDM婦女產后發生T2DM的風險亦顯著升高(RR=7.43)［2］，此均提示 GDM 和T2DM有相同的遺傳發病基礎。已有研究證實2007年GWAS發現的部分T2DM易感基因與GDM的發病風險增加相關［3，4］，但造血干細胞表達同源盒(HHEX)基因rs1111875與中國人群GDM發病的相關性尚不明確。2010年10月～2012年3月，我們采用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性(PCRRFLP)方法對451例妊娠婦女HHEX基因rs1111875的單核苷酸多態性(SNP)進行了檢測，旨在探討其與GDM的相關性及可能的作用機制。(GDM)

1 資料與方法

1.1 臨床資料 24～28周妊娠期婦女451例，年齡22～43歲。行75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)并留取空腹、糖負荷后1 h及2 h血糖，同時采集身高、孕前體質量、血壓［收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)］，并計算孕前 BMI=體質量/身高2(kg/m2)。采用胰島β細胞分泌功能指數(HOMA-B)和穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)評估胰島β細胞功能及胰島素抵抗，計算方法:HOMA-B=20×空腹胰島素(FINS)/(FPG-3.5)，HOMA-IR=FPG×FNS/22.5。采用葡萄糖氧化酶法測定血糖，化學發光法測定血清FINS，在全自動生化分析儀上測定血脂。采用2011年美國糖尿病學會(ADA)診斷標準［空腹血糖(FPG)≥5.1 mmol/L，糖負荷后1 h PG≥10.0 mmol/L，糖負荷后2 h≥8.5 mmol/L，其中1項符合者將被診斷為GDM］［5］。符合診斷標準者(203例)納入GDM組，不符合者(248例)納入糖耐量正常(NGT)組，個體間均無血緣關系。排除標準:其他類型糖尿病及其合并妊娠者;肝腎功能不全(丙氨酸轉氨酶＞正常上限的2倍，血肌酐＞正常上限的1.2倍)及合并慢性炎性疾病者。所有研究對象均簽署知情同意書，研究方案經醫院倫理委員會批準。

1.2 HHEX基因rs1111875G/A多態性檢測方法受試者禁食8～10 h以上，抽取肘靜脈血1 mL抗凝，存放于-20℃冰箱用于提取全血基因組。采用血液基因組提取試劑盒(0.1～1.0 mL)提取DNA(北京天根生化科技有限公司)。引物應用Primer Premer5.0設計，由上海生工生物工程有限公司合成，DL1000 DNA Marker由大連寶生物工程有限公司提供。上游引物序列為5'-AAC ATC TAA ACA AGG GGC AG-3'，下游引物序列為5'-TTT TCC CTT TCA GAC TTG GC-3'。PCR 反應體系為50 μL:PCR Master Mix(2×)25 μL;上游及下游引物(濃度100 μmol/L)各 0.2 μL;模板 DNA 3 μL;ddH2O(nuclease-free)21.8 μL。PCR反應條件:95℃預變性5min，95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸7min。用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，Tanon-3500凝膠成像系統觀察結果。PCR產物酶切反應體系20 μL:10×NEB-uffer4緩沖液2 μL;PCR 產物 10 μL;100×BSA 為0.2 μL;XbaI 0.5 μL;滅菌雙蒸水 7.5 μL。內切酶(XbaI)由北京NEB公司提供。條件:恒溫水浴鍋37℃水浴5 h。用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳，Tanon-3500凝膠成像系統觀測結果。選取部分PCR產物至生工生物工程(上海)有限公司進行基因測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。以Hardy-Weinberg平衡法檢驗各組基因的平衡代表性。正態分布的計量資料采用±s表示，非正態分布資料經對數轉換為正態分布資料后進行分析。組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD法。各組間基因型分布及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，Logistic回歸分析基因與疾病的相關性，并以優勢比(OR)表示。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 目的基因擴增、酶切及測序結果 HHEX基因rs1111875位點PCR擴增產物為長583 bp的片段(見圖1)。應用XbaI進行酶切，因攜帶G等位基因的目的片段不含XbaI的酶切位點，所以GG基因型酶切后顯示一條片段:583 bp，GA基因型顯示三條片段:583 bp、400 bp、183 bp，AA 基因型顯示兩條片段:400 bp和 183 bp(見圖2)。測序結果證實HHEXrs1111875位點有GG、GA、AA三種基因型，且酶切結果符合率為100%。

圖1 rs1111875 PCR產物

圖2 rs13266634多態性酶切結果

2.2 HHEX基因rs1111875單核苷酸多態性分析rs1111875基因型頻率在GDM組和NGT組均符Hardy-Weinberg平衡(P均＞0.05)，提示本研究人群能代表群體分布情況。GDM組GG、GA、AA基因型頻率分別為9.9%、42.4%、47.8%，NGT組分別為4.0%、40.7%、55.2%，兩組比較，P均 ＜0.05。GDM組G、A等位基因頻率分別為31.0%、69.0%，NGT組分別為24.4%、75.6%，兩組比較，P＜0.05。G等位基因攜帶者患GDM的風險是A等位基因的1.40倍(OR=1.395，95%CI為1.040～1.871，P=0.026)。

2.3 HHEX基因rs1111875三種基因型間臨床資料及生化指標比較 GG、GA和AA基因型之間，年齡、孕前 BMI、DBP、FPG、2 h PG、TG、TCH 、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、HOMA-IR的差異均無統計學意義(P均＞0.05)，其余生化指標比較見表1。

表1 各基因型間生化指標比較(±s)

表1 各基因型間生化指標比較(±s)

注:與GG基因型比較，*P＜0.01;與GA基因型比較，△P＜0.05;FINS、HOMA-B均經對數轉換

基因型 n 1 h PG(mmol/L)FINS(mU/L) HOMA-B SBP(mmHg)GG 30 9.7±2.7 2.37±0.30 5.02±0.64 123±13 GA 187 8.9±2.7 2.52±0.27 5.33±0.62 119±11 AA 234 8.3±2.7* 2.52±0.26* 5.37±0.55* 122±12△

2.4 Logistic回歸分析GDM發生的危險因素 以是否發生GDM為因變量，以年齡、孕前BMI、舒張壓、rs1111875基因型為自變量進行二元Logistic回歸分析，結果顯示GA基因型患GDM的危險度增加，為AA基因型的1.32倍，但差異無統計學意義(OR=1.320，95%CI為0.838～2.077，P=0.231)，GG基因型者患GDM的風險是AA基因型的4.1倍(OR=4.129，95%CI為 1.589～ 10.731，P=0.004)，且獨立于年齡、孕前 BMI、舒張壓;年齡增大、孕前BMI升高和DBP升高均為GDM發生的危險因素(OR=1.062～1.387，P 均 ＜0.01)，見表2。

表2 Logistic回歸分析GDM的獨立危險因素

3 討論

HHEX基因位于人類10號染色體q23.33長270kb的連鎖不平衡區，該區域包括三個基因:胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)基因，驅動蛋白家族成員 11(kinesin family member 11，KIF11)基因和 HHEX基因。2007年Slake等［6］發現HHEX-KIF11-IDE區與T2DM有關的基因變異位于HHEX基因的3'端，其中包括rs1111875位點G/A單核苷酸多態性。隨后，多項研究證實了HHEX基因rs1111875G/A多態性與T2DM的相關性［7～9］，Cho等［3］和 Lauenborg 等［4］還報道了 HHEX 基因rs1111875單核苷酸多態性與GDM的發病風險升高有關。

本研究顯示HHEX基因rs1111875基因型頻率分布在GDM組和NGT組明顯不同，這提示HHEX基因rs1111875的三種基因型(GG、GA、AA)與山東濟寧地區GDM的發生有關。GDM組中G等位基因、GG基因型頻率均顯著高于NGT組，G等位基因攜帶者發生GDM的風險是非攜帶者的1.40倍(OR=1.395，95%CI為1.040～1.871，P=0.026)，提示G等位基因可能是GDM的風險等位基因，HHEX基因rs1111875G/A多態性可能與山東濟寧地區GDM有關，此與韓國［3］和丹麥［4］報道的結果相一致。本研究GDM組中GG基因型頻率與韓國人群相似［3］(9.9% vs 11.8%)，但 明 顯 低 于 丹 麥 人 群［4］(37.6%)，推測基因型頻率的不同可能與種族差異及樣本量大小有關。Logistic回歸分析顯示GG基因型為GDM的危險因素，GG基因型攜帶者患GDM的風險是 AA型的 4.1倍(OR=4.129，95%CI為1.589～10.731，P=0.004)，且獨立于年齡、孕前BMI和DBP，這提示攜帶GG基因型者患GDM的風險將大大增加。

GG基因型與AA基因型相比，1 h PG顯著升高(P＜0.01)，而FINS和HOMA-B顯著降低(P均＜0.01)，這提示HHEX基因rs1111875的G等位基因使山東濟寧地區GDM發病風險升高可能是通過減少胰島素分泌實現的。HHEX基因編碼的轉錄因子高表達于胚胎和成熟的胰腺中，并參與Wnt信號轉導通路，調節胰腺β細胞的生長和功能［10，11］。研究表明敲除該基因后，內胚層上皮細胞增殖受損，最終影響胰腺胚芽的發生與形態［10］。因該部分胰腺是胰多肽產生的部位，因此HHEX單核苷酸多態性可能影響胚胎期或成年期激素的產生，并影響胰島素的釋放。據此推測攜帶GG基因型可能使胰島β細胞功能受損，胰島素分泌減低，進而引起血糖升高。此外，本研究未發現HHEX基因rs1111875G/A多態性與GDM患者胰島素抵抗存在相關性。

綜上所述，HHEX基因rs1111875G/A多態性與山東濟寧地區GDM的發生有關，G等位基因可能是其風險等位基因，GG基因型可能與GDM患者胰島素分泌量減低有關，但其具體機制尚不明確。因此，仍需進一步深入研究HHEX基因rs1111875G/A多態性與GDM發病相關的作用機制。

［1］Retnakaran R，Connelly PW，Sermer M，et al.The impact of family history of diabetes on risk factors for gestational diabetes［J］.Clinical Endocrinol(Oxf)，2007，67(5):754-760.

［2］Bellamy L，Casas JP，Hingorani AD，et al.Type 2 diabetes mellitus after gestational diabetes:a systematic review and meta-analysis［J］.Lancet，2009，373(9677):1773-1779.

［3］Cho YM，Kim TH，Lim S，et al.Type 2 diabetes-associated genetic variants discoveredin the recent genome-wide association studies are related to gestational diabetes mellitus in the Korean population［J］.Diabetologia，2009，52(2):253-261.

［4］Lauenborg J，Grarup N，Damm P，et al.Common type 2 diabetes risk gene variants associate with gestational diabetes［J］.Clin Endocrinol Metab，2009，94(1):145-150.

［5］American Diabetes Association.Standards of Medical Care in Diabetes-2011［J］.Diabetes Care，2011，34(suppl 1):S11-S61.

［6］Sladek R，Rocheleau G，Rung J，et al.A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes［J］.Nature，2007，445(7130):881-885.

［7］Wu Y，Li H，Loos RJ，et al.Common variants in CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，SLC30A8，and HHEX/IDE genes are associated with type 2 diabetes and impaired fasting glucose in a Chinese Han population［J］.Diabetes，2008，57(10):2834-2842.

［8］Ng MC，Park KS，Oh B，et al.Implication of genetic variants near TCF7L2，SLC30A8，HHEX，CDKAL，CDKN2A/B，IGF2BP2，and FTO in type 2 diabetes and obesity in 6719 Asians［J］.Diabetes，2008，57(8):2226-2233.

［9］Tan JT，Ng DP，Nurbaya S，et al.Polymorphisms identified through genome-wide association studies and their associations with type 2 diabetes in Chinese，Malays，and Asian-Indians in Singapore［J］.J Clin Endocrinol Metab，2010，95(1):390-397.

［10］Bort R，Martinez-Barbera JP，Beddington RS，et al.Hex homeobox gene-dependent tissue positioning is required for organogenesis of the ventral pancreas［J］.Development，2004，131(4):797-806.

［11］Foley AC，Mercola M.Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodo-main transcription factor Hex［J］.Genes Dev，2005，19(3):387-396.