不同補腎法在腦梗死大鼠體內(nèi)促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用

劉永琦 王 倩 顏春魯 蘇 韞 張 毅 范 萍 吳曉晶 董介正

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目前關(guān)于腦梗死的治療主要有內(nèi)科藥物、外科手術(shù)及血管內(nèi)治療等方法，但迄今為止，尚無理想的內(nèi)科治療或外科手術(shù)方法可以對腦梗死發(fā)生后取得療效。因此，考慮通過干細(xì)胞移植的方法重建神經(jīng)通路，恢復(fù)或改善神經(jīng)功能障礙成為近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的研究熱點〔1〕。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中存在的除造血干細(xì)胞外的另一類干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在一定條件下，可以分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。因BMSCs取材簡便，容易分離純化培養(yǎng)，特別是自身骨髓的取材不受倫理學(xué)及供體組織來源的限制，細(xì)胞移植時可避免免疫排斥反應(yīng)，成為細(xì)胞治療和組織工程的理想種子細(xì)胞。本課題用不同補腎法(補益腎陰法、陰陽雙補法、補益腎陽法)代表方藥左歸丸、地黃飲子、右歸丸含藥血清孵育BMSCs，觀察不同補腎方藥在體內(nèi)對BMSCs的誘導(dǎo)分化作用，探討不同補腎方藥影響B(tài)MSCs移植在腦梗死功能修復(fù)中的機制，為補腎方藥聯(lián)合BMSCs移植治療腦梗死的臨床應(yīng)用提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 提取BMSCs的動物:SPF級Wistar大鼠15只，雌雄不限，體重(120±10)g。制備含藥血清的動物:SPF級Wistar大鼠40只，雌雄不限，體重(250±20)g。造模的動物:SPF級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重(300±30)g。以上動物皆由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號:SCXK(甘)2004-0006。

1.2 實驗藥物 左歸丸、右歸丸、地黃飲子均購自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，經(jīng)中藥教研室鑒定，均為正品。

1.3 主要藥品試劑與儀器 L-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO Invitrogen Corporation，批號1240031)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號090123)，0.25%胰酶(Sigma)，L-谷氨酰胺(上海新興醫(yī)藥保健品科技開發(fā)中心，批號991085)，全反式維甲酸(RA，Sigma)，CD45熒光標(biāo)記抗體(Gibco公司)，CD90熒光標(biāo)記抗體(Gibco公司)，Nestin、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組化試劑盒，熒光FITC試劑盒，兔抗大鼠BrdU抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號2009006);二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO Electric Co.Ltd，型號MOA-18ALC)，超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠，型號 SW-CJ-2FD)，流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定 采用全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)、純化BMSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志CD90及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD45的表達(dá)率。

1.4.2 中藥含藥血清的制備 40只Wistar大鼠，隨機分為4組:空白組、左歸丸全藥組(補益腎陰法代表方藥)、地黃飲子全藥組(陰陽雙補法代表方藥)和右歸丸全藥組(補益腎陽法代表方藥)。晚禁食，第2天，空白組給生理鹽水，其余組給藥液(劑量按1 g生藥/100 g大鼠)，連續(xù)3 d，2次/d;于第3天給藥后2 h從股動脈取血，3 000 r/min，10 min，分離血清，56℃滅活30 min，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 對F3代BMSCs進行補腎方藥含藥血清孵育 將已純化的BMSCs(F3代)接種至培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞70% ～80%融合后，棄完全培養(yǎng)液，隨機分組，分別用含10%左歸丸、右歸丸、地黃飲子中藥血清和維甲酸的L-DMEM培養(yǎng)液孵育，連續(xù)培養(yǎng)3 d。將誘導(dǎo)的BMSCs用0.25%的胰酶消化，待細(xì)胞變形、間隙增大，加入含10%胎牛血清的DMEM中止消化，磷酸鹽緩沖液輕洗，吹打成1×106個/ml細(xì)胞懸液，備用。

1.4.4 MCAO動物模型制備及成功的判定

1.4.4.1 MCAO動物模型的制備 健康Wistar大鼠60只采用文獻〔1〕所報道的線栓法建立Wistar大鼠MCAO模型，10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，將大鼠于頸部正中切開皮膚，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端后，于其近端插入直徑0.25 mm尼龍線，將尼龍線緩慢向顱內(nèi)推進，進線約18 mm左右，略感阻力，即到大腦中動脈起始部，阻斷右側(cè)大腦中動脈2 h后，將尼龍線拔至頸外動脈殘端，剪斷尼龍線，縫合皮膚切口。另設(shè)8只大鼠作為假手術(shù)組對照，僅分離左側(cè)血管和神經(jīng)，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端，不插入尼龍線，即縫合皮膚切口。

1.4.4.2 模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn) MCAO后24 h對大鼠神經(jīng)功能評分，參考Longa及Bederson〔2〕評定神經(jīng)功能缺損程度的5級4分法標(biāo)準(zhǔn)進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為0分:無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:爬行時轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自行行走，意識喪失。評分為1～3分者，提示模型成功，可按預(yù)定方案，給予相應(yīng)的干預(yù)措施。

1.4.5 BMSCs加中藥含藥血清孵育、標(biāo)記 各組細(xì)胞于移植前72 h用無血清L-DMEM洗滌三次后，加入相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，置于37℃、氣體體積分?jǐn)?shù)為5%，濕度飽和的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)誘導(dǎo)。其中，單純BMSCs組誘導(dǎo)液由等量大鼠空白血清代替胎牛血清加入L-DMEM培養(yǎng)液配制而成;各中藥血清組誘導(dǎo)液由等量相應(yīng)含藥血清代替胎牛血清加入L-DMEM培養(yǎng)液配制而成;維甲酸組誘導(dǎo)液先將維甲酸配成質(zhì)量濃度為0.3 mg/L的溶液，加入含10%胎牛血清L-DMEM的細(xì)胞中，誘導(dǎo)劑的最終濃度為2.5 g/L。五組均于移植前48 h做細(xì)胞爬片，加入終濃度為10μmol/L的BrdU液標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并用免疫組化法進行FITC染色，計算標(biāo)記率。

1.4.6 不同補腎方藥含藥血清孵育BMSCs的移植 各組大鼠于造模24 h后，取第3代經(jīng)不同補腎類中藥孵育的各組BMSCs，用胰酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM中止消化，用等滲PBS液吹打成細(xì)胞懸液，然后1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再加入等滲PBS液，吹打成細(xì)胞懸液，讓細(xì)胞充分、均勻懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，并進行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至約2×106個/L。再取細(xì)胞懸液約1 ml于模型大鼠尾靜脈注射。

1.4.7 移植細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志蛋白檢測

1.4.7.1 BrdU雙標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)染色 熒光顯微鏡觀察并拍照。以Nestin抗原表達(dá)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，NSE抗原表達(dá)鑒定分化形成的神經(jīng)元，GFAP抗原表達(dá)鑒定分化形成的膠質(zhì)細(xì)胞，此三者均為胞質(zhì)表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測采用SABC改良法進行。

1.4.7.2 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定 ①BrdU細(xì)胞:BrdU標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)免疫組化SABC-FITC熒光染色后，在熒光顯微鏡(用波長為490～495 nm藍(lán)光激發(fā))下呈黃綠色。隨機在腦組織缺血側(cè)BrdU細(xì)胞豐富區(qū)域，選取不重疊的5個視野進行觀察，對每個視野觀察到的BrdU細(xì)胞進行計數(shù);每組觀察6張切片，合計30個視野。統(tǒng)計每張切片的5個視野下觀察到的BrdU細(xì)胞個數(shù)，取其均值(單位:個/視野)，或?qū)?個視野的細(xì)胞總和納入統(tǒng)計(單位:個/5視野)，下同。②BrdU與Nestin免疫雙標(biāo)細(xì)胞:細(xì)胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，轉(zhuǎn)換熒光顯微鏡后細(xì)胞核中出現(xiàn)黃綠色熒光。③BrdU與NSE免疫雙標(biāo)細(xì)胞:NSE表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞的胞質(zhì)，光學(xué)顯微鏡下觀察，胞漿陽性表達(dá)呈棕褐色，陰性不顯色，細(xì)胞核淡染，在熒光顯微鏡下細(xì)胞核中出現(xiàn)黃綠色熒光。④BrdU與GFAP免疫雙標(biāo)細(xì)胞:分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU與GFAP免疫雙標(biāo)細(xì)胞)的染色特點為胞質(zhì)呈GFAP的紅褐色，轉(zhuǎn)換熒光顯微鏡后細(xì)胞核中出現(xiàn)黃綠色熒光。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件，數(shù)據(jù)均采用±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的形態(tài)及CD90、CD45的表達(dá) F3代細(xì)胞形態(tài)單一均勻，融合后呈典型的極性，漩渦狀生長(如圖1)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志CD90及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD45的表達(dá)，CD90+CD45-細(xì)胞為97.0%。

2.2 BMSCs的標(biāo)記及標(biāo)記率 做細(xì)胞爬片，將BrdU標(biāo)記的BMSCs用免疫組化法進行FITC染色，并用熒光顯微鏡觀察，計算BrdU標(biāo)記率為85.8%(見圖2)。

2.3 移植細(xì)胞Nestin/BrdU雙標(biāo)表達(dá)水平 因假手術(shù)組與模型組未注射細(xì)胞，Nestin/BrdU雙標(biāo)免疫組化全為陰性，故不做比較。與單純細(xì)胞組比較，RA組、地黃飲子與左歸丸組Nestin/BrdU雙標(biāo)陽性表達(dá)率增高明顯(P＜0.05);與7 d時相比，14 d各組Nestin/BrdU雙標(biāo)陽性表達(dá)率，都有下降趨勢(P＜0.05)，見表1。

2.4 移植細(xì)胞NSE/BrdU雙標(biāo)表達(dá)水平 因假手術(shù)組與模型組未注射細(xì)胞，NSE/BrdU雙標(biāo)免疫組化全為陰性，故不做比較。與單純細(xì)胞組比較，RA組與地黃飲子組NSE/BrdU雙標(biāo)陽性表達(dá)率增高明顯(P＜0.05);與7 d時相比，14 d各組NSE/BrdU雙標(biāo)陽性表達(dá)率增高(P＜0.05)，可能原因是由于雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)目增多以及BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目下降兩方面的原因造成，見表2。

2.5 移植細(xì)胞GFAP/BrdU雙標(biāo)表達(dá)水平 因假手術(shù)組與模型組未注射細(xì)胞，GFAP/BrdU雙標(biāo)免疫組化全為陰性，故不做比較。與單純細(xì)胞組比較，RA組與左歸丸組GFAP/BrdU雙標(biāo)陽性表達(dá)率增高明顯(P＜0.05);與7 d時相比，14 d各組NSE/BrdU雙標(biāo)陽性表達(dá)率，有升高趨勢(P＜0.05)，但可能是由于雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)目增多以及BrdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目下降兩方面的原因造成，見表3。

表1 移植細(xì)胞Nestin/BrdU雙標(biāo)表達(dá)水平(x ± s，n=6)

表2 移植細(xì)胞NSE/Brd U雙標(biāo)表達(dá)水平(x ± s，n=6)

圖1 F3代BMSCs

圖2 FITC熒光檢測Brd U細(xì)胞標(biāo)記(×100)

3 討論

腦血管疾病，特別是缺血性腦血管疾病是目前危害中老年人身體健康的主要疾病，大多數(shù)患者留有肢體癱瘓、口眼歪斜、語言功能損傷等不同程度的功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率及高治療費用等特點。根據(jù)中醫(yī)理論，中風(fēng)病的病機較為復(fù)雜，離不開風(fēng)、火、痰、瘀、氣、血六端，而肝腎陰虧為其病機關(guān)鍵，貫穿于中風(fēng)病的整個病理過程。由于患者多為中老年人，積損正衰，臟腑功能虛損，肝腎不足，成為中風(fēng)病發(fā)病的基礎(chǔ)。缺血性中風(fēng)無論在急性期，還是恢復(fù)期，均有一定比例的陰虛血瘀證型存在，同時其他證型的缺血性中風(fēng)病患者在疾病的發(fā)生、發(fā)展中，亦多兼有陰虛血瘀的臨床癥狀表現(xiàn)。正如《馮氏錦囊秘錄·卷一》所述:“中風(fēng)一癥，多由肝陰不足，腎水有虧，虛火上乘，無故猝倒，筋骨無養(yǎng)，偏枯不遂，故滋腎養(yǎng)肝，治本之至要”。因此陰虛是其中的一個重要病理變化，其導(dǎo)致中風(fēng)的病機為陰液不足，脈絡(luò)瘀滯，髓海失養(yǎng)，腦絡(luò)空虛，虛風(fēng)內(nèi)動。

近年來，進行細(xì)胞移植以替代或修復(fù)受損的腦組織為治療缺血性腦損傷帶來了新的曙光。BMSCs是近年來倍受關(guān)注的源于骨髓的細(xì)胞群。BMSCs具有多向分化潛能，易于分離和擴增，來源豐富，低免疫源性，可用于異體移植，不存在倫理問題。因此，BMSCs在組織工程、細(xì)胞和基因治療中，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗利用BMSCs移植修復(fù)和治療大鼠腦缺血損傷。BMSCs從骨髓中分離得到，取材容易;體外分離培養(yǎng)能快速擴增，可以自體移植而且也未發(fā)現(xiàn)明顯免疫排斥反應(yīng)等問題。BMSCs具有高度自我更新和多向分化的能力〔2〕，在一定的條件下可以分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等〔3〕。很多關(guān)于BMSCs對缺血性腦損傷的治療研究表明:BMSCs能夠與宿主大腦整合并存活、遷移。另外，在腦的微環(huán)境中存在一些因素如神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)等，可保護BMSCs在腦中不被破壞，并促進其增殖分化〔4〕。Nestin為存在于神經(jīng)上皮干細(xì)胞中，為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物;NSE主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，為成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物;GFAP存在于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中，為構(gòu)成成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞中間絲的主要成分。

本結(jié)果提示陽性表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)蛋白NSE、Nestin及GFAP，有誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的可能性。在腦缺血微環(huán)境中可能存在一些因素，可引導(dǎo)BMSCs向缺血局部遷移，并保護BMSCs在腦中不被破壞，并促進其進一步分化;并可能存在著BMSCs先分化為神經(jīng)干細(xì)胞，然后再向神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的趨勢不同補腎法在腦梗死大鼠體內(nèi)外能夠促BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，且補陰類代表方左歸丸和陰陽雙補類代表方地黃飲子在體內(nèi)誘導(dǎo)分化的效果優(yōu)于補陽類代表方右歸丸，這也正符合了中醫(yī)“腎生髓，通于腦”理論實質(zhì)。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎“主骨、生髓、通于腦”，三者皆來源于先天的腎之精氣;BMSCs來源于骨髓，而骨髓又屬陰髓，故補益腎陰、陰陽雙補法可促進BMSCs的增殖，并且利于BMSCs在腦內(nèi)的存活及分化，從而達(dá)到對腦缺血損傷后神經(jīng)的保護和修復(fù)作用，從而為補腎法聯(lián)合細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的理論依據(jù)。

1 王 穎，鄧宇斌，李 艷，等.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療腦梗死模型大鼠后運動功能的改善〔J〕.中國病理生理雜志，2006;22(12):2401-6.

2 Kopen GC，Proekop DJ，Phinney DG.Marrow stromal cells migrate through out fore brain and cerebellum，and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009;96(19):10711-6.

3 Carcia JH，Waner S，Liu KF，et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats statistical validation〔J〕.Stroke，1995;26(4):627-35.

4 張化彪，許予明，張?zhí)K明.體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的實驗研究〔J〕.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2003;10(4):276-80.