紅景天對大鼠肝纖維化肝臟組織Smad4、Smad7表達的影響

盧鳳美 劉東璞 王明富 郭夢凡 孟慶媛 盛延良 王 抒

(佳木斯大學司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發展為肝硬化的中間環節，有效的控制肝纖維化進展具有重要的臨床意義。實驗證明紅景天具有保護肝細胞、調節機體免疫功能等多種功效，動物實驗觀察到其具有良好的干預四氯化碳誘導的肝纖維化作用。Smads是一族傳遞TGFβ信號的分子，其中Smad6，7具有抑制作用，Smad4則為傳遞信息必需的共用Smad分子，阻斷或干擾該上述信號轉導通路有可能阻止肝纖維化進程〔1〕，為肝纖維化的治療帶來了新希望。本文針對CCl4中毒性大鼠肝纖維化模型，應用反義寡核苷酸技術及免疫組化技術，以 Smad4及Smad7為靶基因，觀察紅景天對Smad4及Smad7基因表達的影響，進一步從分子水平探討紅景天干預實驗性大鼠肝纖維化的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，質量180～220 g，由佳木斯大學實驗動物中心提供。四氯化碳(CCl4)購自天津石英釧廠霸州市化工廠分廠。紅景天膠囊購自福州恒豐量子生物科技有限公司。組織RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒為立陶宛MBI公司產品。Smad4、Smad7上下游引物及兔抗大鼠Smad4、Smad7的一抗由上海生物工程公司生產。辣根過氧化物酶(HRP)標記的免疫組化通用型羊抗兔的二抗工作液由北京中山生物技術有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 分組 隨機分組:①正常組;②肝纖維化模型組;③復方紅景天治療組。每組20只，各組間暴露因素無差別(P＞0.05)。用CCl4腹腔注射法誘導大鼠肝纖維化模型，即用100 ml/L CCl4(橄欖油稀釋)1 ml/kg，1次/w，共8 w。紅景天干預組在造模的同時給予紅景天灌胃(濃度40 g/L，劑量10 ml/kg，2次/w，共8 w)，肝纖維化模型組造模同時予生理鹽水灌胃，正常組予等量橄欖油和生理鹽水灌胃處理。各組大鼠在最后一次CCl4注射后48 h處死，部分肝臟用4%甲醛固定，留做病理檢查，其余標本迅速放到-80℃冰箱保存。

1.2.2 常規病理學檢查 病理學切片用HE染色，按2000年在西安會議上由中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的慢性肝炎分級分期標準判定肝纖維化程度。

1.2.3 RT-PCR檢測肝組織中Smad4 mRNA、Smad7 mRNA

TRIzol一步法提取組織總RNA，總RNA反轉錄成cDNA，PCR反應。取10μl PCR擴增產物加入25 g/L溴乙啶瓊脂糖凝膠中，以80 V/cm電壓電泳50 min，在紫外線下可見相應的長度的目的基因和內參的擴增條帶，將電泳結果直接置于凝膠分析系統中對條帶進行分析。根據GenBank數據庫，應用Primer-3軟件設計目的基因的擴增引物。Smad 4:上游:5'-TGCAGGTGGCTGGTCGGAAAG-3'，下游:5'-AGGATGATTGGAAATGGGAGGCTG-3'，長度 710 bp，反應條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，28個循環(經多次預試驗摸索最佳實驗條件);72℃ 7 min。SMad7:上 游:5'-TCTCAGGCATTCCTCGGAAGTC-3'，下 游:5'-ACGCC ATCCACTTCCCTTGTC-3'，長 度481 bp，反應條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃50 s，28個循環(經多次預試驗摸索最佳實驗條件);72℃7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后用Bio-RadGel Doc2000型凝膠成像系統照像并用QuangtityOne軟件計算基因相對表達值。

1.2.4 免疫組化檢測肝組織中Smad4、Smad7 用3'，3-二氨基聯苯胺(DAB)二步法檢測肝組織中Smad4、Smad7。方法:石蠟切片經常規脫蠟至水。用30 ml/L H2O2消除內源性過氧化氫酶，以檸檬酸鹽工作緩沖液微波熱修復，用100 ml/L正常山羊血清封閉非特異性抗原，滴加1∶200的一抗，4℃孵育過夜。滴加適量的二抗(HRP標記)工作液，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素液復染，封片。以磷酸鹽緩沖液代替第一抗體作陰性對照。對陽性染色采用HPIAS-2000型高清晰度彩色病理圖文分析系統進行灰度分析，按照Weidner方法，雙盲法閱片，先在低倍鏡下選擇陽性結果密集區域，然后在高倍視野下自動計算A值，取平均值計為該切片的A值。

2 結果

2.1 大鼠肝組織Smad4表達 RT-PCR檢測正常肝組織未見明顯Smad4 mRNA陽性表達細胞;模型組大鼠肝組織Smad4 mRNA的水平較正常組顯著增高(P＜0.01);紅景天治療組大鼠肝組織中Smad4 mRNA的水平較模型組顯著降低(P＜0.05)。免疫組化染色可見正常大鼠肝組織未檢出明顯的Smad4表達，模型組大鼠肝組織則Smad4表達明顯增加，棕黃色陽性顆粒定位于細胞質和細胞核，陽性細胞集中于匯管區，以梭狀的間質細胞為主，肝細胞未見明確陽性反應。紅景天治療組大鼠肝組織Smad4表達較模型組明顯減少，陽性細胞亦主要位于匯管區，以間質細胞為主。各組陰性對照未見陽性表達，證實免疫組化和RT-PCR檢測結果具有特異性(P＜0.05)。見表 1，圖 1、圖 2。

圖1 肝組織中Smad4 mRNA表達的變化

圖2 肝組織中Smad4表達(×100)

表1 肝組織Smad4、Smad7表達的變化(x ± s，n=20)

2.2 大鼠肝組織Smad7表達 RT-PCR檢測正常肝組織未見明顯Smad7 mRNA陽性表達細胞，紅景天干預性治療組大鼠肝組織Smad7 mRNA陽性率高于模型組(P＜0.01);免疫組化染色可見，正常大鼠肝組織未檢出Smad7表達，模型組大鼠肝組織只有少量細胞出現Smad7陽性表達，棕黃色陽性顆粒定位于細胞質，陽性細胞主要位于匯管區，以梭狀的間質細胞為主，肝細胞未見明確陽性反應。紅景天干預性治療組大鼠肝組織Smad7蛋白陽性率高于模型組(P＜0.01)。見表1，圖3、圖4。

圖3 肝組織中Smad7 mRNA表達的變化

圖4 肝組織中Smad7表達(×100)

3 討論

治療肝纖維化的研究是國內外的熱點課題。近年來分子生物學、分子病理學、分子藥理學等邊緣學科的快速發展使人們對肝纖維化發生機制的認識不斷深化。Smads蛋白家族是近年來發現的新的細胞內信號轉導蛋白。大量研究證實TGFβ-Smad信號通路是肝纖維化時主要的信號轉導通路〔2～4〕。根據Smads蛋白在TGF-β家族信號轉導中的作用，將其分為3類:①受體激活型 Smads(R-Smads)，包括 Smad2、Smad3以及Smad1、Smad5、Smad8 和 Smad9，能被 TGF-βⅠ型受體(TβRI)激活并與受體形成短暫復合物〔5〕;②共同通路型 Smads(Co-Smad)，目前只有Smad4，主要通過與受體激活型Smads相連，從而參與信號轉導〔6〕;③抑制型Smads(I-Smads)，包括Smad6和Smad7，可與激活的Ⅰ型受體結合，抑制或調節TGF-β家族的信號轉導〔7〕。TGF-β1是導致組織纖維化最重要的調節因子，與胞膜表面的TβRⅡ結合后，激活TβRⅠ，使Smad2、Smad3磷酸化而活化，繼而與Smad4結合形成復合物，將信號從細胞質轉移至細胞核〔8，9〕。Smad7則可抑制Smads復合物的形成或抑制Smad2、Smad3磷酸化而阻止該信號轉導過程。

近年來，有關中草藥對肝纖維化的防治報道較多，但紅景天對肝纖維化TGFβ-Smad信號通路及Smads影響的研究報道甚少。本文應用半定量RT-PCR與免疫組化的方法，分別從mRNA與蛋白表達水平觀察紅景天對纖維化肝組織中Smad4、Smad7表達的影響，結果顯示模型組中的Smad4蛋白表現為持續性高表達，且主要分布于非實質細胞，說明Smad4在纖維化肝臟主要來源于產生ECM的非實質細胞?？梢奡mad4表達增加及隨后導致的Smads復合物在非實質細胞核內信號傳導的增加，最終誘導了非實質細胞的ECM合成基因的轉錄，表明Smad4過度表達是TGF-β或TβRⅠ持續激活，引起ECM大量堆積的主要原因〔10〕。在纖維化肝臟中，Smad4除了分布于非實質細胞外，肝細胞中也有少量表達，可能是因為TGF-β在肝纖維化的發生中，除了通過刺激肝臟的非實質細胞增殖、合成ECM，還可作用于肝細胞，抑制其再生，誘導肝細胞凋亡〔11〕，從而放大肝損傷形成惡性循環，使纖維化加重;紅景天可以較好防治CCl4損傷性肝纖維化，大鼠肝組織Smad4的表達減少，明顯低于模型組，高于正常對照組;模型組中Smad7表現為全程持續性低表達，未見到反應性上調。用紅景天干預后大鼠肝組織Smad7的表達逐漸增多，明顯高于模型組，高于正常對照組。

本實驗結果表明紅景天通過抑制Smad4、促進Smad7的表達，保護纖維化肝組織內包括HSC在內的細胞周圍正常的基底膜樣細胞間質，抑制HSC的活化與肝纖維化的發展，從而有效地干預了TGFβ介導的肝纖維化信號傳導過程，可能是其抗肝纖維化分子機制之一。

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