慢性腦缺血致認知功能障礙大鼠皮層ROCK2、MBS表達的變化

王立波 莽 靖 劉曉陽 王曉明 何金婷 包曉群 徐忠信

(吉林大學中日聯誼醫院神經內科，吉林 長春 130033)

慢性腦缺血是臨床上常見的腦損傷之一，是阿爾茨海默病、血管性癡呆和Binswanger病等多種疾病發展過程中的一個共同病理過程，其損傷機制尚不完全清楚。本研究前期實驗已證實，Rho激酶(ROCK)2參與慢性缺血性腦損傷過程〔1〕，但其下游作用底物肌球蛋白結合亞單位(MBS)在慢性腦缺血致認知功能障礙中的變化及相關干預對其的影響尚不清楚。本實驗在成功制備慢性腦缺血致認知功能障礙模型基礎上，以ROCK為靶點，探討ROCK2/MBS信號傳導參與慢性腦缺血致認知功能障礙損傷的機制，為慢性腦缺血致認知功能障礙的治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性Wistar大鼠54只，體重320～340 g，由吉林大學實驗動物中心提供，經Morris水迷宮實驗篩選后，隨即平均分為:假手術組、缺血(2VO)組和ROCK抑制劑(法舒地爾)組，每組再根據缺血時間隨機分為3、6、9 w三組，每組6只。

1.2 模型建立及給藥方法 采用雙側頸總動脈永久性阻斷法(2VO)建立慢性腦缺血動物模型〔2〕。ROCK抑制劑(法舒地爾)組于術后48 h內，每天予鹽酸法舒地爾注射液(天津紅日藥業股份有限公司生產)7.5 mg/kg腹腔注射。各模型組于雙側頸總動脈結扎后3、6、9 w，再次麻醉大鼠，斷頭取腦，分離皮層，液氮保存。

1.3 Morris水迷宮實驗 以Morris水迷宮實驗測定空間學習記憶能力。Morris水迷宮由圓形水池、自動攝像機及電腦分析系統組成。記錄大鼠找到站臺的時間(逃避潛伏期，escape lantency)和游泳路徑。如大鼠在120 s內未找到站臺者，潛伏期記為120 s。選取搜索持續時間(逃避潛伏期)和搜索行走路徑(游泳距離)作為評價指標。術后大鼠找到平臺所用時間越長，在此期間走的距離越長，表明其學習記憶保持能力越差，提示學習記憶受損嚴重。數據采集及圖像分析均由圖像自動監視和處理系統完成。

1.4 RT-PCR檢測ROCK2 mRNA表達 大鼠額葉皮層組織經Trizol法抽提總RNA，反轉錄制備cDNA。應用RT-PCR方法檢測ROCK2 mRNA的表達。反應條件為 94℃ 預變性5 min，94℃ 變性30 s，47℃退火 40 s，72℃延伸2 min，共30個循環，72℃再延伸5 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果、照相，用凝膠圖像分析系統掃描后，Bandscan軟件分析條帶灰度，分別計算ROCK2條帶的光密度與相對的β-actin條帶光密度的比值，表示各組mRNA表達水平。引物根據GenBank檢索的核苷酸序列用Premier 5.0軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。見表1。

表1 引物序列和PCR產物長度

1.5 Western印跡檢測ROCK2、MBS蛋白表達 分離提取各時間點腦組織皮層細胞，PBS洗滌2次，每次1 000 r/min，離心5 min;將細胞沉淀溶于150μl細胞裂解液，4℃裂解 30 min;4℃12 000 r/min離心2 min，收集上清即為總蛋白粗提液。應用Bio-rad測定蛋白含量。12%SDS-PAGE電泳(恒壓100 V，3 h)，電泳完畢后進行轉膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h。使用5%脫脂牛奶按比例適當稀釋一抗，然后一抗孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜，加入HRP二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌膜，ECL顯色液曝光。結果用凝膠圖像分析系統掃描后，Bandscan分析條帶灰度，分別計算ROCK2、MBS條帶的光密度與相對的β-actin條帶光密度的比值，表示各組蛋白表達水平。一抗為兔抗鼠ROCK2、MBS(武漢博士德生物制品公司)。

1.6 統計學處理 實驗數據用SPSS12.0統計軟件進行分析，數據結果以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠不同缺血時間學習記憶能力變化 假手術組3、6、9 w大鼠搜索持續時間(逃避潛伏期)和搜索行走路徑(游泳距離)無明顯變化(P＞0.05)，缺血3 w時，大鼠逃避潛伏期和游泳距離明顯延長，與假手術組相比差異顯著(P＜0.05)，缺血6 w和9 w時，與假手術組相比也有顯著差異(P＜0.05)，9 w時，大鼠逃避潛伏期和游泳距離改變最為顯著，與3 w相比有顯著差異(P＜0.05)。表明隨缺血時間延長，大鼠學習記憶能力明顯下降。法舒地爾組各時間點學習記憶成績均較缺血組明顯提高(P＜0.05)，但仍未恢復正常水平。見表2、表3。

表2 各組大鼠不同缺血時間逃避潛伏期(n=6，±s)

表2 各組大鼠不同缺血時間逃避潛伏期(n=6，±s)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與缺血組比較:2)P＜0.05;下表同

13.29±4.76 14.02±3.86 15.45±4.06缺血組 29.16±6.431) 32.24±5.121) 36.65±7.851)法舒地爾組 19.18±3.051)2) 21.54±2.481)2) 23.76±2.971)2)3 w 6 w 9 w假手術組組別

表3 各組大鼠不同缺血時間游泳距離(n=6，cm)

圖1 不同缺血時間ROCK2蛋白及mRNA表達

2.2 大鼠不同缺血時間皮層ROCK2蛋白及mRNA表達 見圖1。假手術組有弱ROCK2蛋白和mRNA表達，缺血3 w后ROCK2蛋白和mRNA表達增加，均高于假手術組(P＜0.05)，且隨缺血時間延長，6 w時出現表達高峰，9 w時表達有所下降，但仍高于假手術組(P＜0.05);法舒地爾干預后，大鼠額葉皮層ROCK2蛋白和mRNA表達均低于同一時間點缺血組(P＜0.05)，但仍高于相同時間點的假手術組(P＜0.05)。

2.3 大鼠不同缺血時間額葉皮層腦組織MBS蛋白表達MBS蛋白檢測結果顯示，與假手術組相比，缺血組和法舒地爾組大鼠各時間點MBS蛋白表達均增高(P＜0.05)，且隨時間延長，MBS蛋白表達增高，6 w時達最高峰，與ROCK表達一致;法舒地爾干預后，大鼠額葉皮層MBS蛋白表達均低于同一時間點的鹽水缺組組(P＜0.05)，但仍高于相同時間點的假手術組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 不同缺血時間MBS蛋白表達

3 討論

慢性腦缺血是臨床上常見的腦損傷之一，目前非常重視對慢性腦缺血致認知功能障礙防治的研究。有研究表明，在腦組織低灌注和低代謝狀態下，大鼠的學習記憶功能可發生減退〔3〕。本研究發現慢性腦缺血可使大鼠逃避潛伏期和游泳路徑均明顯延長，大鼠學習記憶功能發生改變，并隨著時間推移逐漸加重，表明大鼠慢性腦缺血可以導致認知功能障礙。研究結果與Rho激酶可以通過多種途徑影響細胞信號轉導系統，參與血管損傷后內皮細胞和平滑肌細胞增殖以及再狹窄的調控過程相一致〔4〕。

Rho是哺乳類動物Ras基因超家族的一個亞群，被稱為小GTP結合蛋白(小G蛋白)。Rho的下游效應器為Rho激酶(ROCK)，是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，它有兩種細胞亞型，分別是ROCK 1和ROCK 2，ROCK-1在除腦和肌肉外的其他組織中普遍表達，而ROCK2廣泛表達于腦、肌肉、心肺和胎盤。ROCK的主要作用底物是肌球蛋白輕鏈脫磷酸化酶(MLCP)的肌球蛋白結合亞基(MBS)，ROCK的激活本身可以將MLC磷酸化而發生肌絲收縮作用，同時也能將MLCP磷酸化，從而使MLCP失活，阻止了磷酸化的MLC脫磷酸失活，間接促進MLC磷酸化而促進平滑肌收縮〔5〕。Rho和ROCK活性在腦血管疾病中普遍地增加，不僅僅在血管平滑肌，而且在內皮，甚至在炎癥細胞和神經元。ROCK不僅僅參與平滑肌細胞的收縮，還可能通過與ATⅡ、ET21、PDGF等血管活性物質的相互作用參與許多細胞功能的調節，與動脈粥樣硬化、高血壓和缺血性腦損害等血管性疾病的發生和發展關系密切〔6～9〕。本研究結果表明慢性缺血后不但有ROCK的表達上調，并存在功能活化，與認知功能改變平行。因此，ROCK的表達變化與慢性腦缺血認知功能損傷密切相關。

血管平滑肌細胞的收縮取決于胞漿內MLC磷酸化程度，慢性腦缺血致認知功能障礙時血管段肌球蛋白輕鏈磷酸化水平升高。肌球蛋白輕鏈磷酸化水平主要由肌球蛋白輕鏈磷酸酶參與的鈣增敏途徑調節，而并非細胞內 Ca2+濃度的增加〔10，11〕。本研究說明這兩組血管段的肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性下降，導致肌球蛋白輕鏈磷酸化水平升高。ROCK磷酸化肌球蛋白輕鏈結合亞基，使肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活，提高了肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，并增強了鈣增敏作用，使血管平滑肌收縮性增高，腦組織特別是額葉皮層血供發生障礙，導致大鼠學習記憶能力下降。因此，ROCK信號轉導途徑通過增加磷酸化肌球蛋白輕鏈結合亞基，抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性及加強鈣增敏途徑參與了慢性腦缺血致認知功能障礙的發病機制。

自Rho蛋白的發現即開始研制ROCK抑制劑。作用機制主要為通過與ATP競爭ROCK催化區的ATP結合位點而阻斷了ROCK的活性，具有較強的平滑肌松弛作用，對肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)具有抑制作用，從而使血管平滑肌舒張，擴張血管，具有極大的臨床應用價值〔12〕。本研究提示ROCK參與了慢性腦組織低灌注損傷過程，ROCK轉導通路變化可能是慢性腦低灌注后認知功能障礙機制之一。

1 王曉明，莽 靖，徐忠信，等.慢性腦缺血致認知功能障礙大鼠皮層ROCK表達變化〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(4):935-6.

2 Shibata M，Ohtani R，Ihara M，et al.White Matter Lesions and Glial Activation in a Novel Mouse Model of Chronic Cerebral Hypoperfusion〔J〕.Stroke，2004;35(11):2598-603.

3 Fan LW，Lin SY，Pang Y，et al.Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat〔J〕.Behav Brain Res，2005;165(1):80-90.

4 Zhao ZY，Scott AR.Rho-associated kinases play a role in endocardial cell differentiation and migration〔J〕.Develop Biol，2004;275:183-91.

5 Huang L，Li Q，Li H，et al.Inhibition of intracellular Ca2+release by a Rho-kinase inhibitor for the treatment of ischemic damage in primary cultured rat hippocampal neurons〔J〕.Eur J Pharmacol，2009;(2-3):238-44.

6 Kazuo Y，Koh K，Tsuyoshi H，et al.Demonstration of elevation and localization of Rho-kinase activity in the brain of a rat model of cerebral infarction〔J〕.Eur JPharmacol，2008;594(1-3):77-83.

7 Dong-Myung S，Jinmo K，Jongwon H，et al.Cystamine prevents ischemiareperfusion injury by inhibiting polyamination of RhoA〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2008;365(3):509-14.

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9 Hiroaki S，Mamunur R.Development of Rho-kinase inhibitors for cardiovascular medicine〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2007;28(6):296-302.

10 Yuko Fukata，Kazushi Kimura，Noriko Oshiro，et al.Association of the myosin-binding subunit of myosin phosphatase and moesin:dual regulation of moesin phosphorylation by Rho-associated kinase and myosin phosphatase〔J〕.JCell Biol，1998;141(2):409-18.

11 王曉明，邵延坤，徐忠信.Rho激酶在腦血管疾病研究中相關進展〔J〕.中風與神經疾病雜志，2008;25(6):878-80.

12 Fukushima M，Nakamuta M，Kohjima M，et al.Fasudil hydrochloride hydrate，a Rho-kinase(ROCK)inhibitor，suppresses collagen production and enhances collagenase activity in hepatic stellate cells〔J〕.Liver International，2005;25(4):829-38.