TRAIL誘導惡性膠質瘤LN215細胞凋亡抵抗的機制

張艷春 于洪泉 王 猛 趙東海 金 宏 齊 玲 劉興吉

(吉化集團公司總醫院麻醉科，吉林 吉林 132013)

惡性膠質瘤目前尚缺乏理想的治療方法〔1〕。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)作為一種新型的抗腫瘤藥物，在美國已進入臨床Ⅱ期實驗階段〔2〕。但大部分惡性膠質瘤細胞株對TRAIL誘導凋亡發生抵抗〔3〕，其機制仍然不清。本文對惡性膠質瘤細胞LN215細胞和單克隆細胞進行研究，為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人TRAIL(rhTRAIL)(Peprotech公司);DMEM/F12培養基、小牛血清(Gibco公司);對硝基苯(上海生物工程技術公司);兔抗人第二個線粒體激活因子(SMAC)多克隆抗體(Biomol公司);兔抗人BH3結構域凋亡誘導蛋白(BID)多克隆抗體(Invitrogen公司);兔抗人肌動蛋白(actin)多克隆抗體(Sigma公司);過氧化物酶標記IgG第二抗體(Jackson Immunoresearch公司)。

1.2 細胞培養及分離單克隆細胞 將LN215細胞接種于含10%小牛血清的DMEM/F12培養基中培養，待細胞匯合至80%～90%，用0.25%胰酶消化，臺盼藍計數后稀釋。按1～2個/孔細胞密度接種于96孔板中進行培養。培養條件為5%CO2，37℃孵箱。每天觀察生長情況，標記出含單個細胞的孔。待其匯合，轉入24孔板中進行培養。每周換液2次，90%匯合后轉入65 mm培養皿中進行培養。

1.3 酸性磷酸酶法檢測細胞凋亡的百分率 待細胞融合至85%，0.25%胰酶消化，臺盼藍計數活細胞后，以1×104個/孔細胞密度接種于96孔板中，培養24 h，將細胞分為11組，加入TRAIL(0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100，300 ng/ml)，對照組使用基礎培養基。24 h后小心棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去培養基，每孔加入酸性磷酸酶底物檢測液(對硝基苯新鮮配制)100μl，繼續培養90 min，加入終止液，室溫下孵育5 min。酶標儀405 nm處測定各孔光吸收值。按照公式計算細胞凋亡率=(1-藥物組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.4 Western印跡法檢測蛋白的表達 收集細胞，3 000 r/min離心后棄上清。PBS洗滌細胞離心后棄上清，每個管中加入50μl細胞裂解液，12 000 r/min 4℃ 離心 15 min，棄去沉淀，Braford測定法檢測樣品蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離樣品，4℃轉膜封閉，加入一抗4℃過夜。加入二抗，室溫、避光孵育1 h，膠片曝光拍照。

1.5 統計學分析 采用SPSS11.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，行t檢驗。

2 結果

2.1 LN215細胞及單克隆細胞的培養 惡性膠質瘤LN215細胞經復蘇后培養，細胞呈現長梭形，有的可見明顯的突起。觀察96孔板內含單細胞孔細胞的生長狀態發現:雖然細胞來自于同一株細胞，但各單克隆細胞生長速度不同、形態也不全相同。待細胞生長至90%時，挑選出生長速度與形態均不相同的32株細胞，用胰酶消化轉入24孔板生長，細胞生長狀態良好。比較后發現有5株單克隆細胞生長形態、生長速度不同，編號分別是1、6、17、13和32。這5株細胞用于后續實驗。

2.2 LN215細胞和單克隆細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性LN215和5株單克隆細胞經不同濃度TRAIL作用后，細胞凋亡率在 -10.2% ～55.7%之間波動，LN215、1、6、17、13 和 32 細胞的最大凋亡率分別為12.1%、3.48%、17.4%、4.85%、55.7%和28.1%，其中6、13和32經TRAIL作用后發生凋亡較LN215更明顯，而1和7則相反，以13對TRAIL誘導凋亡最為敏感。見圖1。

2.3 LN215細胞和單克隆細胞TRAIL相關蛋白的表達TRAIL相關蛋白均有表達。LN215細胞和單克隆細胞表達DR4與細胞凋亡百分率不相關;BID、SMAC表達與細胞凋亡百分率明顯相關，6、13、32較1和17表達量明顯增加，尤其是13最為明顯。見圖2。

圖1 TRAIL誘導LN215及單克隆細胞發生凋亡情況

圖2 惡性膠質瘤LN214細胞及單克隆細胞TRAIL相關蛋白的表達

3 討論

膠質瘤是起源于中樞神經系統的最常見腫瘤，由于其發病隱匿，一經發現病理診斷就是Ⅲ～Ⅳ期膠質瘤，給臨床治療帶來了很大困難。并且由于腦膠質瘤在腦內呈彌散分布〔4〕，手術難以清除。這可能是由于激活細胞生長途徑和/或抑制細胞凋亡途徑而對治療產生抵抗〔5〕。TRAIL可以誘導膠質瘤細胞凋亡〔6，7〕，TRAIL誘導凋亡的非線粒體途徑需要線粒體途徑的補充，由線粒體途徑通過(caspase 8)間接激活BID，再依次與Bax和Bak作用，改變了線粒體膜的生物學特性，促使細胞色素C和SMAC等線粒體蛋白釋放。在胞質內，SMAC與相關蛋白作用解除抑制因子的抑制作用，使TRAIL誘導的非線粒體途徑得以進行〔8，9〕，細胞發生凋亡。

根據腫瘤發生可能來源于多個細胞的突變，本實驗利用細胞梯度稀釋方法由LN215分離出5株單克隆細胞。LN215細胞和單克隆細胞BID、SMAC表達與細胞凋亡百分率明顯相關。因此，筆者認為LN215和單克隆細胞經TRAIL誘導凋亡百分率與BID和SMAC表達量密切相關，說明TRAIL誘導LN215和單克隆細胞可能是通過BID和SMAC引起，表達量的減少可能會引起TRAIL誘導凋亡抵抗，但更進一步的機制仍待研究。

1 Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med，2005;352(10):987-96.

2 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Revi Rec Clin Trials，2009;(4):34-41.

3 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

4 Holland EC.Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-44.

5 Lefranc F，Brotchi J，Kiss R.Possible future issues in the treatment of glioblastomas:special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells to apoptosis〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(10):2411-22.

6 南栗巖，齊 玲，肖振晶，等.原代培養的惡性膠質瘤細胞表達死亡受體與TRAIL抵抗的關系〔J〕.中國老年學雜志，2011;18(1):3591-2.

7 齊 玲，于洪泉，丁麗娟，等.Caspase-8在膠質母細胞瘤抵抗TRAIL誘導凋亡中的作用〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2011;37(4):612-6.

8 Li H，Zhu H，Xu CJ，et al.Cleavage of BID by caspase8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis〔J〕.Cell，1998;94(8):491-501.

9 Du C，Fang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition〔J〕.Cell，2000;102(1):33-42.