金屬硫蛋白3對(duì)快速老化癡呆小鼠海馬膠原纖維酸性蛋白表達(dá)的影響

馬飛煜 蔡君賢 陳曉燕 田賢先

(汕頭市中心醫(yī)院暨中山大學(xué)附屬汕頭醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 汕頭 515041)

阿爾茨海默病(AD)發(fā)病前提是腦的衰老，在腦衰老過(guò)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)和代謝方式上均發(fā)生很多變化，從而加重神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功下降。膠原纖維酸性蛋白(GFAP)是一種僅存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠原纖維中間絲，是該種細(xì)胞的特異性標(biāo)記物〔1〕。GFAP變化可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。快速老化癡呆模型小鼠SAMP8是目前公認(rèn)的比較理想的自然衰老癡呆模型〔2～5〕，主要以學(xué)習(xí)記憶能力障礙為老化特征，其壽命約為12.1個(gè)月。SAMR1作為SAMP8的正常對(duì)照，表現(xiàn)為正常衰老。金屬硫蛋白3(MT3)只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)，具有特定條件下發(fā)揮生長(zhǎng)抑制因子、調(diào)節(jié)微量金屬元素代謝、清除自由基等作用〔6〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦中MT3含量明顯減少〔7〕，而GFAP表達(dá)增加，本實(shí)驗(yàn)研究二者之間表達(dá)是否有關(guān)聯(lián)，采用SAMP8小鼠為癡呆模型，檢測(cè)外源性MT3作用于SAMP8小鼠后海馬結(jié)構(gòu)GFAP的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 一抗(兔抗鼠GFAP多克隆抗體)，二抗(生物素化羊抗兔 IgG/Biotin)由Santa Cruz公司提供。MT3由北京大學(xué)生命科學(xué)院蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。Image-pro plus圖像分析系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SAMR1小鼠作為正常組。將SAMP8小鼠(7月齡)隨機(jī)法分成5組:癡呆組、對(duì)照組(生理鹽水，0.2 ml/10 g)、低、中、高濃度 MT3 組(75、150、300 μg/ml)。每組10只。由天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。連續(xù)28 d腹腔注射給藥，停藥1 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫組化法染色海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞 各組小鼠用4%多聚甲醛灌注取腦，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，浸蠟，石蠟包埋制成蠟塊。海馬區(qū)石蠟切片，脫蠟和脫水。1%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加一抗、二抗，滴加Streptavidin-HRP溶液。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。對(duì)照用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)海馬GFAP水平 小鼠處死后，取海馬組織置于4℃預(yù)冷的組織裂解緩沖液中勻漿，12 000 r/min離心后取上清。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加一抗(1∶1 000)4℃ 過(guò)夜。PBST洗膜4次，每次7 min。加二抗(1∶3 000)室溫1 h，PBST洗膜4次，每次7 min。最后用超敏發(fā)光液化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。

1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化圖片光密度(IOD)值分析。Image-J分析軟件對(duì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行灰度定量分析。數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間方差檢驗(yàn)和兩組間t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠海馬結(jié)構(gòu)GFAP的表達(dá) GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)如蜘蛛狀，周圍有放射狀突起，突起相互交織成網(wǎng)，并伸入到錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞層神經(jīng)元間，胞質(zhì)呈紅棕色。癡呆組海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)可見大量濃染的GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，體積肥大，突起密集、粗長(zhǎng)，胞質(zhì)和突起著色較深。正常組海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)的GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞較少，細(xì)胞體積較小，突起短細(xì)，胞質(zhì)和突起著色較淺。癡呆組〔(20.59±1.96)×106〕和正常組〔(12.49±1.43)×106〕組間GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著給予MT3濃度的增加，癡呆組海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)的GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞減少，突起短細(xì)，細(xì)胞體積較小，著色較淺。高濃度MT3組的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞最少，IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。高濃度MT3組〔(13.58±1.61)×106〕與正常組比較，IOD值稍多，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高濃度MT3組、中濃度MT3組〔(15.49±1.62)×106〕較對(duì)照組〔(19.56±1.45)×106〕明顯降低(P ＜0.05)，低濃度MT3組為〔(17.94±1.54)×106〕。說(shuō)明MT3有抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，體現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制的作用。

2.2 各組小鼠海馬結(jié)構(gòu)GFAP的表達(dá) 與正常組相比，癡呆組小鼠海馬GFAP含量增加90%(P＜0.01)。3種濃度MT3處理后的癡呆組小鼠海馬結(jié)構(gòu)的GFAP表達(dá)量均下降，高濃度組下降40%左右。與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬GFAP表達(dá)的Western印跡結(jié)果

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)組織的修復(fù)和再生起著十分重要的作用，神經(jīng)元的活動(dòng)也影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞含有一種特異性標(biāo)記物——GFAP，它是一種僅存在于該細(xì)胞的膠原纖維中間絲蛋白。GFAP表達(dá)量的增加反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生和活化。當(dāng)各種原因?qū)е滦切文z質(zhì)細(xì)胞腫脹時(shí)，其突起增多，延長(zhǎng)，GFAP表達(dá)明顯增多。過(guò)度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放腫瘤壞死因子(TNF)、白介素、干擾素等有害因子導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元死亡;一氧化氮、細(xì)胞因子IL-6、載脂蛋白J(SP40)、α2-巨球蛋白、集落刺激因子如粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等亦會(huì)損害神經(jīng)末梢，導(dǎo)致斑塊炎癥改變和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)的形成，加速受損神經(jīng)元的凋亡和導(dǎo)致癡呆〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SAMP8小鼠較SAMR1小鼠海馬結(jié)構(gòu)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP的過(guò)度表達(dá)，可能是導(dǎo)致癡呆的重要因素之一。

MT3于1991年首次被發(fā)現(xiàn)，它只在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)。MT3具有特定條件下發(fā)揮生長(zhǎng)抑制因子、清除自由基、調(diào)節(jié)微量金屬元素代謝等作用。MT3的生長(zhǎng)抑制功能最早是基于MT3在AD腦提取物的存在下對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，因而最初將其命名為生長(zhǎng)抑制因子〔10〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MT3有減少GFAP的表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用，間接起到神經(jīng)元的保護(hù)作用，從而對(duì)AD有一定治療作用。

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