c-Jun氨基端激酶對亞急性帕金森病小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響

劉 江 李 冉 李 磊 楊國海 張宇新 張作鳳 (河北聯(lián)合大學(xué)解剖學(xué)教研室，河北 唐山 063000)

帕金森病(PD)是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性缺失。迄今為止，PD的發(fā)病機制仍不清楚。有研究認(rèn)為，c-Jun氨基端激酶(JNK)可能與PD發(fā)病機制密切相關(guān)〔1，2〕。本研究采用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)制備 PD 小鼠模型，觀察模型動物中腦黑質(zhì)磷酸化c-Jun(p-c-Jun)與dUTP缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)陽性神經(jīng)元數(shù)量的關(guān)系，以及給予JNK特異性抑制劑SP600125對上述指標(biāo)的影響，探討JNK通路在MPTP誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的可能作用，為制定有效的PD防治策略提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MPTP(Sigma，USA)，兔p-c-Jun單克隆抗體(Ser63，Cell Signaling Technology，USA)，預(yù)染蛋白 Marker(天津灝洋生物)，TUNEL試劑盒(美國IBM 公司)。

1.1.2 實驗動物 健康雄性C57BL/6N小鼠45只(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔SCXX(京)2002-0003〕)，6～8周齡，體質(zhì)量18～23 g，清潔級(SPF)，飼養(yǎng)于華北煤炭醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實驗室動物房，自由進食飲水，室溫(25±2)℃，單籠喂養(yǎng)，自然光照，飼養(yǎng)1 w后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 分組和MPTP小鼠PD模型制備 取C57BL/6N小鼠45只隨機分成模型組、JNK抑制劑組和對照組，每組15只小鼠。①模型組:腹腔注射MPTP(30 mg/kg，鹽水溶)，1次/d，連續(xù)5 d;②JNK抑制劑組:在MPTP注射前6～8 h經(jīng)側(cè)腦室注射SP600125(30 μg/5 μl，溶于 10 g/L DMSO);③對照組:注射與模型組和抑制劑組等體積的生理鹽水和10 g/L DMSO。于每次注射藥物后觀察小鼠行為變化，以判斷PD模型是否成功。

1.2.2 標(biāo)本采集 分別于末次注射后24 h以20%烏拉坦麻醉，經(jīng)左心室生理鹽水灌洗后，再行4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定，迅速開顱取腦，4%多聚甲醛后固定48 h(4℃)，石蠟包埋、切片。用于免疫印跡法檢測的動物，取黑質(zhì)置于4℃預(yù)冷的全細(xì)胞裂解液0.6 ml冰水浴中勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液。以考馬斯亮藍(lán) G 250結(jié)合法蛋白定量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 組織學(xué)檢查 切片行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下(×400)觀察缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)病理改變。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測 腦組織切片常規(guī)脫蠟至水后，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)(pH 7.4±0.2)洗3次，每次3 min;組織抗原行水浴法熱修復(fù);30 ml/L過氧化氫阻斷內(nèi)源過氧化物酶，TBST洗3次;用正常非免疫動物血清室溫孵育10 min;同一組織相鄰切片加入兔p-c-Jun單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜;TBST洗3次后，加入生物素標(biāo)記第二抗體室溫孵育20 min;TBST洗3次，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，中性樹膠封固，所有切片在同一條件下采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度值。

1.2.5 TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞 按原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒提供的實驗步驟進行，DAB顯色。細(xì)胞核中有黃褐色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞。于光鏡下(×200)隨機計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，與形態(tài)學(xué)分類作為分析對象進行比較。

1.2.6 免疫蛋白印跡檢測 蛋白定量后加入4倍體積樣本緩沖液，95℃變性5 min。取20μg樣品在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入p-c-Jun單抗(1∶200)4℃過夜，TBST沖洗后，分別與生物素標(biāo)記的羊抗兔/小鼠IgG抗血清(1∶200)室溫震蕩孵育2 h，TBST洗滌后，與卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物室溫下孵育0.5 h，DAB顯色。將特異性蛋白條帶用掃描儀掃描，在同一條件應(yīng)用CMIAS真彩醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定條帶平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結(jié)果以±s表示，兩指標(biāo)間相關(guān)性用簡單相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PD模型小鼠行為學(xué)變化 對照組未出現(xiàn)任何行為學(xué)變化;模型組小鼠于MPTP首次注射20 min后，均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、弓背、翹尾、活動減少、動作變慢等癥狀，四肢肌張力增高，協(xié)調(diào)性差，并伴有煩躁、呼吸急促等精神癥狀;抑制劑組與模型組比較上述行為學(xué)癥狀明顯減輕。

2.2 中腦黑質(zhì)區(qū)組織病理學(xué)結(jié)果 對照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元排列整齊，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，未見異常改變。與對照組比較，模型組正常神經(jīng)元數(shù)目相對減少，少數(shù)神經(jīng)元胞質(zhì)腫脹，部分神經(jīng)元胞體皺縮，胞質(zhì)強嗜酸性、核固縮深染，細(xì)胞呈桿狀或三角形外觀，周邊空泡形成，細(xì)胞間隙顯著增寬。與模型組比較，抑制劑組變性壞死神經(jīng)元減少。

2.3 免疫組化檢測結(jié)果 對照組黑質(zhì)區(qū)僅見微量的p-c-Jun表達(dá)于胞質(zhì)。與對照組比較，模型組p-c-Jun免疫反應(yīng)陽性增強，且主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)(P＜0.05);與模型組比較，抑制劑組p-c-Jun表達(dá)下調(diào)，且部分表達(dá)于胞質(zhì)(P＜0.05)。見表1。

2.4 TUNEL法檢測結(jié)果 對照組僅有少量TUNEL陽性細(xì)胞。與對照組相比，模型組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05);與模型組相比，抑制劑組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P＜0.05)。見表1，圖1。

表1 三組p-JNK平均光密度、灰度分析和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量(x ± s，n=6)

圖1 TUNEL法檢測結(jié)果(×200)

2.5 免疫蛋白印跡法檢測結(jié)果 在預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)約Marker 46 000～48 000處，可見p-c-Jun特異性蛋白條帶。灰度分析發(fā)現(xiàn)，對照組僅有微量p-JUK蛋白表達(dá);模型組p-JUK蛋白表達(dá)增強(P＜0.05);與模型組相比，抑制劑組p-JUK表達(dá)降低(P＜0.05)。見表1。

2.6 相關(guān)性分析 p-JUK免疫反應(yīng)性與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(r=0.825，P ＜0.05)。

3 討論

目前，PD發(fā)病的確切機制仍不清楚，尚缺乏有效的、針對性的治療方法，研究證實細(xì)胞凋亡可能在PD發(fā)病過程中起重要作用〔3〕。凋亡存在于胚胎神經(jīng)元的早期發(fā)育過程和接受廣泛刺激的多種細(xì)胞系中，在各種神經(jīng)退行性疾病中也廣泛存在。JNK通路的活化可導(dǎo)致神經(jīng)性萎縮和死亡，此過程和神經(jīng)退行性疾病如PD密切相關(guān)〔4〕，在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型以及在PD病人死后的尸檢中，均可以檢測到活化的JNK。基因敲除實驗亦表明，敲除JNK2、JNK3的小鼠比野生型小鼠更能抵制MPTP的毒性〔5〕。另外，MPTP應(yīng)用到小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中，可使p-JNK和絲裂原活化蛋白激酶4(MKK4)水平分別提高2.5～5倍，JNK抑制劑CEP1347可抑制MPTP介導(dǎo)的MKK4和JNK信號，從而減少DA能神經(jīng)元的喪失，表明JNK通路參與并促進PD引發(fā)的凋亡樣細(xì)胞死亡。因此，抑制JNK信號通路可望成為治療PD的一個治療靶點。本實驗中，模型組小鼠黑質(zhì)p-c-Jun陽性細(xì)胞顯著增加并核內(nèi)表達(dá)，同時伴有行為學(xué)異常、中腦黑質(zhì)區(qū)組織病理學(xué)改變及TUNEL表達(dá)增高，提示p-c-Jun及其后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)可能與DA能神經(jīng)元凋亡存在密切關(guān)系。研究證實，在上游激活物的作用下，JNK的氨基末端可被磷酸化而激活，激活的p-JNK可使轉(zhuǎn)錄因子c-Jun氨基末端磷酸化，使p-c-Jun進入核內(nèi)影響基因的表達(dá)調(diào)控〔6〕，從而參與應(yīng)激或病理刺激引起的細(xì)胞凋亡過程。Hunot等〔7〕報道在PD模型動物p-c-Jun顯著升高并有時間依賴性，MPTP處理后12 h發(fā)生核轉(zhuǎn)位;JNK特異性抑制劑可以減弱MPTP導(dǎo)致的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元丟失。本課題組前期實驗業(yè)已證明，MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)存在p-c-Jun顯著活化，給予人參皂甙治療后，其表達(dá)減少，小鼠行為學(xué)癥狀得到改善〔8〕。p-c-Jun免疫反應(yīng)性與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，進一步證實本實驗復(fù)制的PD模型中p-c-Jun的活化與細(xì)胞凋亡可能存在著內(nèi)在的聯(lián)系。由此可以推測，當(dāng)細(xì)胞接受上游信號刺激后，黑質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，這種信號由細(xì)胞膜上的第一信使傳入細(xì)胞內(nèi)，繼之由胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)如JNK傳入胞核，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)錄一系列反應(yīng)。

本實驗觀察到，SP600125可以阻抑p-c-Jun活化及由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡。在抑制劑組逆轉(zhuǎn)黑質(zhì)細(xì)胞p-c-Jun核移位，黑質(zhì)區(qū)p-c-Jun核陽性細(xì)胞減少，多數(shù)細(xì)胞呈胞質(zhì)陽性。SP600125減少了c-Jun磷酸化，同時發(fā)現(xiàn)TUNEL的表達(dá)均有顯著下降趨勢，此結(jié)果提示SP600125可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，在凋亡啟動階段減緩細(xì)胞內(nèi)一系列的激酶磷酸化，推延PD損傷信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f至細(xì)胞核的過程;神經(jīng)元丟失現(xiàn)象減輕可能在一定程度上通過阻斷JNK通路啟動細(xì)胞凋亡過程來實現(xiàn)的。

盡管JNK細(xì)胞凋亡通路的具體作用機制還需進一步研究，但本實驗結(jié)果提示，以JNK為靶點的藥物在一定程度上可減少PD的DA能神經(jīng)元凋亡，這對探討PD的防治舉措具有重要的實用價值。

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